羊傳染性膿皰病毒VIR蛋白對(duì)宿主細(xì)胞p53和IFN-α的調(diào)控.pdf

1、羊傳染性膿皰病毒（orf virus, ORFV）屬于痘病毒科，副痘病毒屬，可引起一種接觸性人獸共患傳染病。ORFV主要感染山羊和綿羊，臨床上主要表現(xiàn)為嘴唇、鼻、口腔黏膜出現(xiàn)丘疹、水皰、膿皰和結(jié)節(jié)。該病發(fā)病率高，死亡率相對(duì)較低，若繼發(fā)其他病原感染則死亡率升高。人感染后主要表現(xiàn)為手背、指間和前臂出現(xiàn)皰疹和破潰。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重制約養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)也威脅相關(guān)從業(yè)人員的身體健康。
　　ORFV自身編碼一系列拮抗宿主免

2、疫應(yīng)答的蛋白，導(dǎo)致感染后雖能引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，卻能夠反復(fù)感染同一宿主。VIR是ORFV編碼的免疫調(diào)節(jié)蛋白之一，具有拮抗干擾素（interferon, IFN）的活性，目前其作用機(jī)制尚不清楚。p53是細(xì)胞內(nèi)的一種多功能蛋白，在抗病毒先天性免疫方面發(fā)揮重要作用。研究表明p53能夠抑制許多病毒的復(fù)制，且與I型IFN通路有重要的聯(lián)系。VIR對(duì)宿主細(xì)胞p53以及IFN-α是否具有調(diào)控作用是本文主要研究目的，為此本文做了以下研究：
　　

3、1. VIR蛋白對(duì)宿主細(xì)胞IFN-α的調(diào)控
　　為研究VIR蛋白對(duì)IFN-α表達(dá)的影響，本研究以山羊成纖維上皮細(xì)胞（GSFs）為對(duì)象，使用仙臺(tái)病毒（SeV）單獨(dú)刺激、SeV與VIR共同刺激GSFs，使用定量ELISA方法檢測(cè)GSFs上清中IFN-α的濃度，結(jié)果顯示VIR蛋白對(duì)SeV刺激的IFN-α表達(dá)和分泌有明顯的抑制作用。
　　2. VIR蛋白對(duì)宿主細(xì)胞p53的調(diào)控
　　首先檢測(cè)了ORFV感染細(xì)胞后p53表達(dá)水平的變

4、化，結(jié)果顯示在ORFV感染早期對(duì)p53的表達(dá)有抑制作用。將構(gòu)建的VIR的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，研究VIR對(duì)p53表達(dá)的影響，結(jié)果顯示VIR在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)后，p53 mRNA水平和蛋白水平明顯降低。表明ORFV對(duì)p53的抑制作用與VIR蛋白有關(guān)。
　　3. ORFV感染過程中p53對(duì)IFN-α下游干擾素刺激基因（ISGs）表達(dá)的調(diào)控
　　建立了基于VIR基因的SYBR GREEN法檢測(cè)ORFV拷貝數(shù)的方法，檢測(cè)

5、了p53表達(dá)受到抑制后，ORFV在羊皮膚成纖維細(xì)胞中的復(fù)制水平，繪制p53抑制組和p53正常對(duì)照組ORFV的生長曲線，結(jié)果表明抑制p53表達(dá)后ORFV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平升高。本研究還證實(shí)抑制p53表達(dá)時(shí)，IFN-α刺激或ORFV感染后，干擾素刺激基因IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1的表達(dá)量相對(duì)于p53正常對(duì)照組表達(dá)量明顯降低。構(gòu)建p53的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，熒光定量 PCR檢測(cè) ISG

6、s的表達(dá)量，結(jié)果表明 IRF7，IRF9，ISG15，ISG20，GBP1，OAS1基因的表達(dá)量升高。將VIR質(zhì)粒、p53質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中后，細(xì)胞的IRF7，IRF9，ISG15，ISG20， GBP1，OAS1基因的轉(zhuǎn)錄水平相比只轉(zhuǎn)染p53質(zhì)粒組明顯降低，表明VIR能夠抑制p53對(duì)ISGs轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)。
　　全文研究結(jié)果證實(shí)ORFV編碼的VIR蛋白能抑制宿主p53基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)；VIR蛋白能夠抑制宿主細(xì)胞IFN