豬傳染性胃腸炎病毒非結構蛋白nsp14誘導IFn-β的分子機制.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起豬的傳染性胃腸炎，該病以感染豬的嘔吐、嚴重腹瀉和脫水為主要特征，不同年齡的豬均易感，兩周齡以內仔豬的感染死亡率可高達100％。TGEV還常與豬流行性腹瀉病毒、豬δ冠狀病毒等引起腹瀉的病毒發(fā)生混合感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。
　　干擾素(IFN)及其誘導的干擾素刺激因子是宿主抗病毒感染的重要防御機制，為了能有效感染宿主和增殖，很多病毒進化出各種策略拮抗宿主IFN的抗病毒作用，但也有些病毒

2、感染后能誘導干擾素的產生。有研究證實TGEV感染能誘導干擾素的產生，但對其分子機制研究甚少?；诖?，本研究對TGEV感染激活IFN-β的分子機制進行了初步探討，以期為進一步闡明TGEV的免疫機理和致病機制及有效預防和控制TGEV感染提供理論依據。
　　1.TGEV感染PK-15細胞呈劑量依賴性激活IFN-β
　?、裥透蓴_素作為主要的抗病毒效應分子在宿主體內廣泛表達，參與宿主免疫調控并誘導抗病毒效應。將TGEV以不同劑量感染P

3、K-15細胞，利用啟動子雙熒光素酶報告系統檢測證實TGEV感染顯著激活IFN-β、IRF3和NF-κB，且呈劑量依賴性。說明TGEV感染激活IFN-β可能同時依賴于IRF3和NF-κB轉錄因子的調控。
　　2.TGEV編碼的非結構蛋白nsp14顯著激活IFN-β
　　許多病毒編碼蛋白會參與激活或調節(jié)IFN-β信號通路。將TGEV所有編碼蛋白的真核表達質粒分別與IFN-β、NF-κB和IRF3啟動子熒光素酶報告質粒及內參質粒共

4、轉染HEK-293T細胞，雙熒光素酶檢測證實TGEV編碼的非結構蛋白nsp14能顯著激活IFN-β和NF-κB，但對IRF3的激活倍數不高，說明TGEV nsp14對IFN-β的激活主要依賴于NF-κB。
　　3.TGEV nsp14誘導NF-κB活化的分子機制
　　p65的磷酸化和轉核是NF-κB活化的標志，通過Western blot和間接免疫熒光實驗，發(fā)現TGEV nsp14能夠促進p65的磷酸化和轉核。進一步將TGE

5、V nsp14的截短突變體和酶活性位點突變體的真核表達質粒和NF-κB啟動子熒光素酶報告質粒共轉染細胞，熒光素酶活性檢測證實nsp14的外切核酸酶活性和N7-甲基轉移酶活性都與其誘導NF-κB活化有關。
　　4.TGEV激活IFN-β的信號通路機制研究
　　解旋酶蛋白DDX1是新發(fā)現的識別受體，研究證實SARS-CoV和IBV編碼的nsp14蛋白都能與DDX1相互作用，為了確定TGEV nsp14是否通過DDX1誘導IFN-

6、β及其信號通路。首先通過免疫共沉淀實驗和間接免疫熒光實驗對nsp14與DDX1是否存在相互作用進行了檢測，證實兩種蛋白確實存在相互作用。進一步通過超表達或者干擾DDX1，熒光素酶系統分析發(fā)現超表達DDX1能夠協同nsp14誘導IFN-β產生，而干擾DDX1的作用則相反，表明TGEV nsp14通過宿主蛋白DDX1誘導抗病毒反應。最后通過檢測干擾DDX1后TGEV誘導的IFN-β、ISGs和炎癥因子產生水平的變化，發(fā)現TGEV誘導的抗病毒

7、反應均顯著下調，提示TGEV很可能通過nsp14與DDX1的互作介導宿主的免疫識別，從而激活抗病毒反應。
　　5.DDX1對TGEV增殖的影響初步研究
　　許多解旋酶蛋白能夠通過與病毒編碼蛋白互作，幫助或抑制病毒的增殖。為了分析DDX1對TGEV增殖的影響，通過超表達或干擾DDX1，TCID50檢測、實時熒光定量PCR和Western blot實驗，確定DDX1對TGEV的增殖有一定的抑制作用。
　　6.TGEV感染對