豬傳染性胃腸炎病毒感染誘導(dǎo)腸上皮細胞線粒體自噬的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一種高度接觸性、急性消化道傳染病。TGEV感染的靶細胞是小腸上皮細胞。小腸上皮作為營養(yǎng)吸收的主要位點細胞內(nèi)含有大量的線粒體。有一些病毒專門以線粒體為調(diào)控靶點，促進自身在細胞內(nèi)復(fù)制和存活;有一些病毒通過與自噬受體相互作用、引起細胞

2、應(yīng)激等方式誘導(dǎo)自噬，增加病毒復(fù)制;還有一些病毒通過激活線粒體自噬受體、誘導(dǎo)線粒體損傷等方式引起線粒體自噬，促進病毒的持續(xù)感染。目前，關(guān)于TGEV與線粒體自噬相互作用的研究還未見報道。因此，為了探究線粒體自噬在TGEV感染中的作用和意義，我們應(yīng)用豬空腸上皮細胞IPEC-J2作為TGEV的感染模型，首先研究了TGEV對線粒體損傷和線粒體自噬的影響;其次研究了線粒體自噬對TGEV復(fù)制的影響;再次研究了細胞氧化應(yīng)激對TGEV誘導(dǎo)線粒體自噬的影響

3、;最后通過對TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的過表達，尋找誘導(dǎo)線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白。具體內(nèi)容如下:
　　1、TGEV感染IPEC-J2細胞誘導(dǎo)線粒體損傷和自噬的研究
　　在病毒感染過程中，某些病毒能夠通過引起線粒體損傷和自噬促進自身的持續(xù)感染。首先，為了研究線粒體在TGEV感染IPEC-J2細胞過程中是否存在損傷和自噬，流式細胞術(shù)檢測了TGEV感染后細胞內(nèi)的線粒體損傷程度和線粒體數(shù)量變化，并通過透射電鏡觀察了TGEV感染后細胞

4、線粒體的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGEV感染12 h和24 h后細胞內(nèi)的線粒體膜電位明顯降低(P＜0.01)，線粒體形態(tài)出現(xiàn)明顯腫脹變形，嵴消失，并觀察到明顯的雙層膜包裹的線粒體。其次，為了確定TGEV感染是否激活細胞自噬清除受損的線粒體，通過Western-blot和流式細胞術(shù)檢測TGEV感染后自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的變化以及線粒體數(shù)量的變化。結(jié)果證明，自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ在TGEV感染24 h到48 h

5、之間含量都明顯增加(P＜0.01)，感染12h和24 h后線粒體數(shù)量又明顯減少(P＜0.01)，但在感染48 h后恢復(fù)。為了進一步證明TGEV感染誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，通過共聚焦顯微鏡觀察IPEC-J2細胞內(nèi)線粒體和自噬體是否存在共定位現(xiàn)象。試驗結(jié)果表明，TGEV感染12h后可見明顯的線粒體與自噬體的共定位，隨著感染時間延長，共定位現(xiàn)象更加明顯。最后為了確定TGEV引起的線粒體自噬是否完全，通過檢測p62/SQSTM1蛋白變化以及線粒體與

6、溶酶體的融合現(xiàn)象，證明TGEV感染24h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)能促進p62/SQSTM1蛋白的降解，促進線粒體和溶酶體的融合，誘導(dǎo)產(chǎn)生完全的線粒體自噬。以上結(jié)果顯示TGEV感染IPEC-J2細胞能引起線粒體的損傷和線粒體自噬。
　　2、線粒體自噬對TGEV復(fù)制和細胞凋亡影響的研究
　　線粒體自噬可以抑制細胞凋亡，促進病毒的復(fù)制;也可以降低線粒體數(shù)量，減少能量產(chǎn)生，抑制病毒的復(fù)制。為了確定線粒體自噬是否影響T

7、GEV的復(fù)制，通過自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)、自噬促進劑雷帕霉素（Rapamycin）和線粒體自噬促進劑羰基氰化物間氯苯腙(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone，CCCP)處理IPEC-J2細胞改變細胞自噬水平，檢測自噬抑制或激活對TGEV的滴度和N蛋白表達的影響。試驗結(jié)果表明，自噬抑制劑3-MA能顯著降低TGEV感染24 h和48 h的滴度(P＜0.0

8、1),并且細胞凋亡明顯增加(P＜0.01);自噬促進劑Rapamycin和線粒體自噬促進劑CCCP都能增加TGEV感染24 h和48 h后滴度(P＜0.01)，CCCP對TGEV感染24 h(P＜0.05)和48h(P＜0.01)后N蛋白的表達有顯著促進作用，雷帕霉素對TGEV感染48 h(P＜0.05)后N蛋白的表達有顯著促進作用。為了排除藥物處理的非特異性作用，通過RNA干擾技術(shù)抑制自噬蛋白ATG5的表達，同樣得到了與3-MA相似的

9、結(jié)果。以上結(jié)果顯示線粒體自噬通過抑制細胞凋亡促進TGEV的復(fù)制。
　　3、線粒體氧化應(yīng)激對TGEV誘導(dǎo)線粒體自噬影響的研究
　　線粒體的氧化應(yīng)激是介導(dǎo)線粒體自噬的主要途徑。為了確定TGEV引起的線粒體自噬是否與線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)，通過流式細胞術(shù)檢測了TGEV感染后細胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、線粒體ROS和一些抗氧化基因的表達變化。試驗結(jié)果表明，TGEV感染后細胞總ROS水平并沒有明

10、顯升高，而線粒體ROS在感染12h后有少量增加，在感染24 h到48 h后出現(xiàn)明顯的增加(P＜0.01);抗氧化基因SCD、Nrf2和eNOS在感染12h到72 h之間都出現(xiàn)明顯上調(diào)(P＜0.01)。另外，用還原劑谷胱甘肽(GSH)降低ROS后，可以抑制TGEV感染（2 h到48 h）引起的LC3-Ⅱ的表達(P＜0.01)和線粒體數(shù)量的減少(P＜0.01)。為了進一步確定線粒體氧化應(yīng)激是調(diào)控TGEV引起線粒體自噬的主要原因，通過RNA干

11、擾技術(shù)降低監(jiān)控線粒體氧化應(yīng)激蛋白D J-1的表達，證明DJ-1干擾能夠明顯抑制TGEV的復(fù)制(P＜0.01)，線粒體數(shù)量、異常線粒體比例和細胞凋亡比例在TGEV感染12h到48 h之間也出現(xiàn)增加(P＜0.01)。以上結(jié)果均顯示，線粒體氧化應(yīng)激在介導(dǎo)TGEV感染引起的線粒體自噬中發(fā)揮了重要作用。
　　4、TGEV的N蛋白誘導(dǎo)線粒體自噬的研究
　　某些病毒蛋白可以直接定位到線粒體上，導(dǎo)致線粒體異常和線粒體自噬。為了進一步探究TG

12、EV引起線粒體異常和線粒體自噬的原因，通過構(gòu)建TGEV的M、N、E、PLP1蛋白的慢病毒表達載體并轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞觀察這些蛋白的線粒體定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGEV結(jié)構(gòu)蛋白N有明顯的線粒體定位現(xiàn)象。對N蛋白穩(wěn)定表達細胞的線粒體數(shù)量、膜電位、ROS和線粒體ROS的檢測發(fā)現(xiàn)，N蛋白能促進細胞和線粒體ROS水平升高(P＜0.01)，降低細胞線粒體數(shù)量(P＜0.01)，但對膜電位和細胞凋亡沒有明顯影響。為了進一步確定N蛋白是否是誘導(dǎo)線粒體自

13、噬的原因，通過檢測TGEV感染的細胞中N蛋白亞細胞定位情況，證明N蛋白在TGEV感染時也存在明顯的線粒體定位現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，TGEV的N蛋白是誘導(dǎo)IPEC-J2細胞發(fā)生線粒體損傷和線粒體自噬的重要原因。
　　本論文以豬小腸上皮細胞為模式細胞證明了細胞線粒體自噬在TGEV的復(fù)制中發(fā)揮著重要的作用，TGEV的N蛋白是造成線粒體損傷和線粒體自噬的重要原因。本研究為深入研究TGEV感染與線粒體自噬的相互作用機制，揭示TGEV在腸上皮細