Profilin2及其信號通路在口腔鱗癌中的作用研究.pdf

1、目的:課題前期應用比較蛋白質(zhì)組學的研究方法,通過構建口腔黏膜上皮細胞癌變模型,已篩選出了45個口腔鱗癌細胞系與口腔永生化正常上皮細胞系之間的潛在差異蛋白質(zhì)。前期實驗結果已經(jīng)驗證了部分癌或抑癌基因對口腔鱗癌細胞生長,增殖及轉移的調(diào)控作用。此實驗旨在通過進一步篩選驗證Profilin2在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中的作用,并探討該家族蛋白及其相關信號通路蛋白的抑癌作用機制。
　　方法:1.通過分析口腔鱗癌質(zhì)譜芯片分析結果,篩選出Profili

2、n2基因,并通過RT-PCR,Realtime-PCR,Western blotting實驗方法驗證該基因:在正常口腔粘膜永生化上皮細胞系及多個不同口腔鱗癌細胞系,口腔正常上皮組織,口腔鱗癌組織中的轉錄及表達水平的差異。
　　2.收集88個原發(fā)口腔鱗癌患者的鱗癌組織及癌旁正常蠟塊(成對),通過分析所有患者的預后相關信息進行分組,進而驗證Profilin2的蛋白質(zhì)表達水平的差異對口腔鱗癌患者預后水平的潛在影響。
　　3.通過P

3、rofilin2的蛋白熒光染色,并同時應用激光共聚焦的定位方法,明確Profilin2在永生化口腔黏膜正常上皮細胞及口腔鱗癌細胞中的亞細胞定位。利用細胞質(zhì)核蛋白分離技術,進一步驗證其細胞定位及差異表達。
　　4.通過質(zhì)粒瞬時轉染profilin2基因過表達技術,上調(diào):Profilin2基因的蛋白質(zhì)表達,并研究Profilin2對口腔鱗癌細胞增殖及調(diào)亡,細胞活力的影響。
　　5.通過Realtime PCR,Western b

4、lotting的方法,初步驗證相關信號通路P27/Cyclin D/CDK與N-WASP/Arp2/3在Profilin2質(zhì)粒轉染后的表達差異,并推測其作用機制。
　　結果:1.通過二維電泳液相質(zhì)譜分析,從口腔鱗癌細胞系中篩選出了Profilin1及Profilin2的差異表達蛋白質(zhì),通過Hb96,Tca8113,OSC,CAL27,NT等5個不同口腔鱗癌細胞系與永生化正常口腔黏膜上皮細胞系HIOEC比較,并選取32個口腔鱗癌患者

5、的RNA標本,在mRNA轉錄水平及蛋白表達水平上驗證了Profilin2表達下調(diào)的芯片實驗結果。
　　2.免疫組化及Realtime-PCR的結果顯示:在收集的88對口腔鱗癌組織內(nèi),Profilin2的mRNA轉錄水平及蛋白質(zhì)表達水平均有較明顯下降。將該組患者依照腫瘤部位、大小、血管侵犯、淋巴結轉移、臨床分期、病理分級等情況進行分組,統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)Profilin2的表達水平與患者總體生存率顯著相關(P＜0.001)。
　　

6、3.通過激光共聚焦顯微鏡的熒光成像方法及核質(zhì)分離技術,顯示Profilin2在口腔鱗癌細胞中的亞細胞定位:細胞核及細胞質(zhì)。
　　4.通過構建pQCXIH-Profilin2質(zhì)粒,并進行瞬時轉染、上調(diào)Profilin2基因在口腔鱗癌細胞系HB96中的表達。觀察該基因上調(diào)后,HB96癌細胞出現(xiàn)增殖減緩,細胞活力下降的變化。
　　5.通過轉染pQCXIH-Profilin2質(zhì)粒,觀察72小時后Profiilin2相關蛋白的RNA轉

7、錄,蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)Profilin2對P27的表達無明顯調(diào)控作用,但對N-WASP/Arp2/3通路的表達有一定相關性。
　　結論:1.Profilin2在口腔鱗癌細胞系及患者組織中均有較明顯下調(diào),而Profilin1在口腔鱗癌與正?？谇徽衬ど掀そM織中表達基本均為高表達。
　　2.Profilin2基因在口腔粘膜上皮內(nèi)的表達產(chǎn)物主要位于細胞核及細胞質(zhì)內(nèi);但在口腔鱗癌細胞中,Profilin2的亞細胞定位發(fā)生改變,主要位于

8、細胞核內(nèi)。此結果意味著Profilin2在鱗癌細胞中的作用方式可能有相應的改變。
　　3.Profilin2的表達下調(diào),與許多口腔鱗癌患者的總體生存率密切相關,Profilin2可能是一個重要的口腔鱗癌生物預后指標。
　　4.通過升高Profilin2的表達,抑制了HB96鱗癌細胞的生長,并使鱗癌細胞的運動活力下降,證明Profilin2是一個抑癌基因,是一個潛在的藥物靶點。
　　5.Profilin2對口腔鱗癌細胞的