魚鰾作為新型心血管外科手術(shù)生物材料的試驗(yàn)研究.pdf

1、生物材料(Biomaterials)已在心血管外科領(lǐng)域得到廣泛使用,其中又以生物心臟瓣膜和人工血管使用較多。生物瓣膜因血流動(dòng)力學(xué)出色、血栓栓塞發(fā)生率低、術(shù)后生活質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn),尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家已有較高的認(rèn)可度,但由于牛心包等異種材料本身原因,早期即可能出現(xiàn)機(jī)械性毀損和鈣化衰敗,大大限制了生物瓣膜的適用范圍。大口徑人工血管已成功應(yīng)用于心血管手術(shù)且術(shù)后效果好,而小口徑人工血管(口徑＜6mm)因血液相容性差導(dǎo)致的術(shù)后通暢率低等原因,仍未獲得臨床認(rèn)

2、可。因此,目前人們正在努力通過對(duì)現(xiàn)有材料加工改性及尋找新材料的角度出發(fā)以期解決以上問題。由此目的出發(fā),本文分別從物理性能、體外生物相容性及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)不同層面深入研究魚鰾性質(zhì),旨在尋求一種優(yōu)于目前臨床常用材料的新型心血管外科生物材料。
　　 第一部分魚鰾的物理性能試驗(yàn)研究
　　 目的:研究魚鰾各項(xiàng)生物力學(xué)性能和熱穩(wěn)定性,以及交聯(lián)處理（0.625％戊二醛溶液）對(duì)其性能的影響。
　　 方法:1、通過單軸拉伸試驗(yàn)(Un

3、iaxial Tensile Test)獲得被測(cè)材料拉伸至毀損時(shí)的極限阿爾曼西應(yīng)變（Failure Almansi strain,εf）、極限柯西應(yīng)力(Failure Cauchy stress,σf)以及極限彈性模量(Peak Elastic Modulus,Mp),比較新鮮、戊二醛處理后的魚鰾在不同方向上和牛心包的力學(xué)差異。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)中維多利亞藍(lán)-苦味酸酸性復(fù)紅染色(Victoria blue-van Gieson,VG)染色、透射

4、電鏡觀察以及本試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)纖維排列做出描述。2、通過差示量熱掃描技術(shù)（Differential Scanning Calorimetry,DSC）檢測(cè)新鮮和戊二醛處理后魚鰾的熱變性溫度并分析交聯(lián)處理對(duì)其熱穩(wěn)定性的影響。
　　 結(jié)果:1、單軸拉伸試驗(yàn):(1)無論新鮮或是戊二醛交聯(lián)后魚鰾在周向的三個(gè)力學(xué)結(jié)果均高于縱向。(2)戊二醛處理后魚鰾周向的σf、 Mp均高于同方向的新鮮魚鰾,兩者εf無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)戊二醛交聯(lián)后魚鰾縱向

5、εf大于同方向新鮮魚鰾,兩者σf、Mp無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)戊二醛處理后牛心包σf、 Mp均高于新鮮牛心包,兩者εf無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(5)兩材料經(jīng)戊二醛處理后,魚鰾周向及縱向σf、 Mp均低于牛心包,εf顯著高于牛心包。2、差示量熱掃描:新鮮魚鰾熱變性溫度高于正常人體溫范圍,且戊二醛處理后魚鰾熱穩(wěn)定性優(yōu)于新鮮時(shí)。
　　 結(jié)論:1、魚鰾纖維排列較牛心包規(guī)則,膠原纖維主要沿周向排列,彈力纖維在周向及縱向均有分布。2、戊二醛處理后魚鰾

6、僵硬度（Stiffness）低于牛心包,延展性優(yōu)于牛心包,更接近人正常主動(dòng)脈瓣膜力學(xué)范圍。3、魚鰾,尤其經(jīng)過戊二醛處理后,熱穩(wěn)定性可達(dá)到體溫要求。
　　 第二部分魚鰾生物相容性體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)
　　 目的:根據(jù)國(guó)際ISO10993醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)指南研究魚鰾體外細(xì)胞毒性及血液相容性。
　　 方法:1、體外細(xì)胞毒性試驗(yàn):用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)液浸提新鮮魚鰾,采用MTT法檢測(cè)浸提液對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞

7、毒性作用。2、體外血小板激活試驗(yàn):用人全血浸提魚鰾,通過CD62p檢測(cè)法計(jì)算活化血小板數(shù)量。3、體外溶血試驗(yàn):用無菌生理鹽水浸提魚鰾,采用游離血紅蛋白直接測(cè)定法檢測(cè)浸提液與人血混合后的游離血紅蛋白含量并計(jì)算溶血率。以上試驗(yàn)均以牛心包材料作為試驗(yàn)對(duì)照組。
　　 結(jié)果:1、100％新鮮魚鰾和100％新鮮牛心包浸提液接觸后的L929細(xì)胞活力分別為85.7％和94.2％,可認(rèn)為兩材料對(duì)L929細(xì)胞無毒性影響。2、戊二醛處理后魚鰾和牛心包

8、組CD62P百分率分別為0.94±0.27％和1.73±0.35％,可認(rèn)為兩材料均對(duì)體外人血血栓形成沒有影響。3、戊二醛處理后魚鰾和牛心包組溶血率分別為0.2％和0.6％,可認(rèn)為兩材料對(duì)體外溶血沒有影響。
　　 結(jié)論:魚鰾材料在體外細(xì)胞毒性檢測(cè)和體外血液相容性檢測(cè)中表現(xiàn)出良好的生物相容性并為進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分魚鰾體內(nèi)鈣化研究
　　 目的:采用大鼠背部皮下埋植模型,定性及定量評(píng)估魚鰾不同時(shí)

9、間點(diǎn)鈣化程度,并與牛心包進(jìn)行對(duì)比。
　　 方法:1、采用已在牛心包中驗(yàn)證有效的DSC(Denaturant-surfactant-crosslinking)抗鈣化方法（美國(guó)Edwards公司專利,Patent No.:US6214054B1）預(yù)處理魚鰾及牛心包材料,行幼年大鼠背部皮下埋植,于術(shù)后7天、21天、56天取出樣本,定性及定量檢測(cè)鈣化情況并明確與免疫反應(yīng)的關(guān)系。2、鈣定性檢測(cè):采用X線攝影、HE染色、VG染色及Von K

10、ossa染色從樣本形態(tài)學(xué)和組織學(xué)水平評(píng)價(jià)各時(shí)間點(diǎn)鈣鹽沉積情況。3、鈣定量測(cè)定:采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Indutive Coupled Plasma EmissionSpectrimeter, ICP)對(duì)比分析樣本鈣含量。4、免疫組織化學(xué):CD68+巨噬細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞特異性免疫組化染色研究材料內(nèi)部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況,并與鈣化程度關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)果:1、魚鰾各期鈣化程度均低于牛心包,魚鰾纖維完整排列有序,僅在后期局部鈣

11、化處發(fā)生纖維斷裂,牛心包早期出現(xiàn)鈣鹽沉積,纖維破壞嚴(yán)重。定量測(cè)定表明牛心包各期鈣含量高于魚鰾組,以21天時(shí)差異最顯著。2、免疫組化染色顯示各時(shí)期魚鰾內(nèi)部未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而牛心包各期均有CD68+巨噬細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞浸入。
　　 結(jié)論:大鼠皮下埋植鈣化模型顯示經(jīng)戊二醛-DSC抗鈣化方法處理后魚鰾各期鈣化程度顯著低于牛心包,魚鰾在體內(nèi)具有更出色的抗鈣化性能。
　　 第四部分新型材料小口徑人造血管的試驗(yàn)研究
　　

12、 目的:采用大鼠腹主動(dòng)脈置換模型評(píng)估魚鰾作為小口徑人造血管材料的效果,并與牛心包相比較,進(jìn)一步評(píng)估兩者的血液相容性。
　　 方法:根據(jù)ISO10993指南,使用魚鰾和牛心包材料制作小口徑人造血管并行大鼠腹主動(dòng)脈置換,于30天及60天取出并觀察如下指標(biāo)。1、通暢率及血管瘤觀察:采用320排CT掃描并三維成像觀察通暢率及血管瘤形成。2、內(nèi)皮化及新生內(nèi)膜觀察:采用掃面電鏡直觀觀察內(nèi)皮細(xì)胞黏附,采用HE、VG染色觀察通暢血管管壁纖維排列

13、及彈力纖維增生,采用第八因子相關(guān)抗原及α-SMA免疫組化染色觀察人造血管各期纖維排列、內(nèi)皮化及平滑肌細(xì)胞增生程度。3、鈣化研究:采用X線體外攝影及離體樣本Micro CT掃描初步評(píng)估血管壁鈣鹽沉積,采用組織切片Von Kossa染色鏡下進(jìn)一步觀察鈣鹽沉積情況。
　　 結(jié)果:1、各期魚鰾人造血管通暢率均為100％,牛心包人造血管均為16.67％。通暢血管均未見血管瘤形成。2、通暢血管各期纖維排列有序,僅60天牛心包血管可見纖維破壞

14、斷裂,兩者通暢血管均可見彈力纖維覆蓋,魚鰾血管中彈力纖維更豐富;魚鰾內(nèi)皮化與牛心包比較速度更快程度更完整;兩材料吻合口處均可見平滑肌細(xì)胞增生,30天及60天魚鰾內(nèi)膜厚度無明顯差異,30天時(shí)牛心包內(nèi)膜增生較魚鰾顯著,60天時(shí)牛心包內(nèi)膜幾乎堵塞管腔。3、X線體外攝影及離體樣本Micro CT掃描均未發(fā)現(xiàn)血管中明顯鈣化點(diǎn),經(jīng)組織切片Von kossa染色顯示,僅60天時(shí)牛心包血管材料管壁可見鈣鹽點(diǎn)狀沉積并致纖維斷裂,其余時(shí)期兩者通暢血管中均未

15、見鈣鹽沉積。
　　 結(jié)論:魚鰾材料血液相容性優(yōu)于牛心包,可以作為小口徑人造血管材料。
　　 全文總結(jié):
　　 本課題研究表明,鯉魚鰾最大斷裂強(qiáng)度低于牛心包,延展性及柔韌性優(yōu)于牛心包,熱穩(wěn)定性能達(dá)到人體內(nèi)使用要求。魚鰾生物相容性優(yōu)良,無細(xì)胞毒性、致血栓形成及致溶血的性質(zhì)。大鼠皮下埋植模型結(jié)果表明,經(jīng)抗鈣化處理后,鈣化率顯著低于牛心包。魚鰾小口徑人造血管行大鼠腹主動(dòng)脈置換結(jié)果表明,魚鰾材料作為人造血管,血液相容性滿意