Rsf-1在肺癌中的表達(dá)及其對肺癌遷移侵襲能力的影響.pdf

1、前言
　　近年來肺癌發(fā)病率持續(xù)升高，已成為惡性腫瘤死因的第一位。而大部分肺癌患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此發(fā)現(xiàn)肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點具有重要意義。
　　Rsf-1與hSNF2H形成染色質(zhì)重塑復(fù)合物RSF，在這個復(fù)合物中Rsf-1作為組蛋白分子伴侶調(diào)整復(fù)合物與DNA的結(jié)合活性，同時hSNF2H利用其ATP酶活性和解螺旋酶活性參與核小體的移動和DNA的解螺旋。RSF復(fù)合物動員核小體調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)以適應(yīng)各種生長信號和環(huán)境變化的

2、需求。已報道這種核小體的改變也發(fā)生在其他ISWI復(fù)合物和SWI/SNF復(fù)合物中，且它在轉(zhuǎn)錄的激活或抑制，DNA的復(fù)制，細(xì)胞周期的進(jìn)展中有一定作用。越來越多的證據(jù)表明染色質(zhì)重塑參與調(diào)控細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。有研究證實在多個腫瘤組織中包括卵巢癌、乳腺癌、膀胱上皮癌、結(jié)腸癌、胃腺癌、口腔鱗癌、非小細(xì)胞肺癌等Rsf-1異常過表達(dá)，且其高表達(dá)與增殖、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)參數(shù)及預(yù)后相關(guān)。提示Rsf-1在腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等方面起一定的作用。已有報道顯

3、示在有Rsf-1表達(dá)的卵巢癌，結(jié)腸癌，直腸癌，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中Rsf-1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　但是Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系未見文獻(xiàn)報道，其對肺癌細(xì)胞運動侵襲的作用及其作用機(jī)制還不清楚。本課題擬通過免疫組化，westernblot，Rsf-1siRNA，Transwell等方法研究肺癌組織及細(xì)胞系中Rsf-1的表達(dá)情況，探討Rsf-1對肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能的機(jī)制和信號途徑，為肺癌的診斷和

4、治療提供新的基因靶點。
　　材料和方法
　　1、組織來源
　　具有完整隨訪資料的61例非小細(xì)胞肺癌及相應(yīng)正常肺組織標(biāo)本均來自2005年到2007年在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實行手術(shù)的病人，所有標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢查確診，并經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。組織經(jīng)10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋?；颊咝g(shù)前均未接受放化療。隨訪時間截止至2012年5月。
　　2、免疫組織化學(xué)染色
　　將石蠟組織塊

5、切成4μm厚切片，脫蠟，水化，按S-P法說明操作?？筊sf-1的單克隆抗體(1∶1000，Upstate，USA)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。同時以PBS代替—抗作為陰性對照。兩名病理診斷醫(yī)師分別對組織切片染色情況進(jìn)行評分。結(jié)果判定:Rsf-1以細(xì)胞核染色為陽性細(xì)胞。根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞百分比:0％記為0分，1-5％記為1分，6-25％記為2分，26-75％記為3分，76-100％記為4分。同時根據(jù)染色強(qiáng)度:陰性或淺黃色記為0分，黃色記

6、為1分，棕褐色顆粒記為2分。著色細(xì)胞數(shù)得分乘以著色強(qiáng)度得分為Rsf-1得分。我們將得分為0-3分記做Rsf-1低表達(dá)，得分為4-8分記做Rsf-1高表達(dá)。
　　3、細(xì)胞培養(yǎng)與siRNA干擾
　　HBE、A549、H1299、H460、H157、LK2細(xì)胞系從ATCC(Manassas，VA，USA)細(xì)胞庫獲得。PG-BE1(BE1)，PG-LH7(LH7)細(xì)胞系來自zhengjie教授的友好惠贈，SPC-A-1(SPC)和L

7、TEP-A-2(LTE)細(xì)胞系于上海細(xì)胞庫獲得，Anip973、AGZY83a細(xì)胞系購自上海拜利生物科技有限公司，這12種細(xì)胞系用含10％胎牛血清的RPMI1640(sigma，USA)或RPMIDMEM(sigma，USA)培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。Rsf-1siRNA(h)與controlsiRNA購自Santa。轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞按50％密度接種于6孔板，采用lipo2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72小時Wes

8、ternblot檢測干擾效率。
　　4、WesternBlot和細(xì)胞漿/核蛋白提取
　　收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解，低溫高速離心(4℃，12000轉(zhuǎn)/min，15min)，提取上清為總蛋白。按細(xì)胞漿/核提取試劑盒提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法蛋白定量，上樣蛋白量為60ug。8％和10％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)，5％脫脂奶粉封閉，抗Rsf-1(1∶1000

9、，Millipore，USA),MMP-2、MMP-7、MMP-9(1∶250,proteintech),NF-κB、Rho-A、Rho-B、Rho-C、E-cadharin(1∶100,SantaCruz),Snail(1∶250,CellSignaling,Boston,MA，USA)和β-actin、GAPDH(1∶1000，SantaCruz)4℃孵育過夜，分別與對應(yīng)的二抗(1∶1000，SantaCruz)室溫孵育2h，ECL

10、(Pierce)顯色，結(jié)果經(jīng)BioImagingSystem(UVPInc,Upland,CA,USA)采集。
　　5、細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測
　　用含2％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)至2.5×106個/ml細(xì)胞，取100ul加入上室中(孔徑8um，Costar，USA)，下室加入600ul含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24小時后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，預(yù)冷甲醇室溫固定1

11、5min，用棉簽輕擦掉上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下聚碳酸酯微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測定用預(yù)冷的無血清的RPMI1640培養(yǎng)基以1∶3稀釋Matrigel(BDBiosciences，USA)加入上室20ul，37℃、5％CO2放置3小時。調(diào)至5×106個/ml細(xì)胞，取100ul加入上室中。使用前將培養(yǎng)基吸凈，其他與遷移實驗相同，培養(yǎng)30小時后觀察結(jié)果。
　　6、數(shù)據(jù)分析
　　采用SPSS1

12、7.0統(tǒng)計分析軟件，生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank檢驗判斷差異性，其它實驗結(jié)果采用t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有意義。
　　結(jié)果
　　1、Rsf-1蛋白過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后相關(guān)
　　我們采用免疫組化方法檢測了Rsf-1蛋白在61例非小細(xì)胞肺癌及其癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況。Rsf-1在正常支氣管上皮及肺泡上皮均為陰性表達(dá)或弱著色。在61例非小細(xì)胞肺癌中Rsf-1低表達(dá)的為2

13、9例，低表達(dá)率為47.5％，高表達(dá)為31例，高表達(dá)率為52.5％。生存曲線顯示Rsf-1高表達(dá)肺癌患者的生存期低于Rsf-1低表達(dá)者。
　　2、在兩種肺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Rsf-1特異性siRNA抑制肺癌細(xì)胞遷移侵襲
　　Westernblot方法檢測HBE及11種肺癌細(xì)胞系中Rsf-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在H1299和H460細(xì)胞中Rsf-1高表達(dá)。我們采用Rsf-1特異性siRNA干擾其在肺癌細(xì)胞系H1299和H460中的表達(dá)，

14、通過westernblot檢測轉(zhuǎn)染效率。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染72小時后，與轉(zhuǎn)染亂序siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染特異性干擾的細(xì)胞Rsf-1的表達(dá)明顯下降。Transwell遷移實驗證明下調(diào)Rsf-1蛋白表達(dá)，H1299及H460細(xì)胞的遷移能力受抑制。Transwell侵襲實驗證明下調(diào)Rsf-1蛋白表達(dá)，H1299及H460細(xì)胞的侵襲能力受抑制。
　　3、干擾Rsf-1下調(diào)肺癌細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)
　　為了研究干擾Rsf-1后肺癌細(xì)胞侵

15、襲能力下調(diào)的機(jī)制，我們檢測了黏附相關(guān)蛋白和運動侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。我們發(fā)現(xiàn)，干擾Rsf-1后H1299和H460細(xì)胞中MMP-2蛋白含量下調(diào)。因此，Rsf-1干擾所致的遷移侵襲能力下調(diào)可能是由MMP-2下調(diào)所導(dǎo)致的。
　　4、干擾Rsf-1可能通過NF-κB通路下調(diào)MMP-2的表達(dá)
　　蛋白相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明AKT、ERK和NF-κB信號通路活性可能受Rsf-1蛋白調(diào)控。有研究證實Rsf-1調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，因

16、此在干擾Rsf-1后我們檢測了NF-κB通路活性，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)的NF-κB減少。提示Rsf1可能激活NF-κB信號通路。進(jìn)一步應(yīng)用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082處理H460和H1299細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MMP-2的蛋白水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，與干擾Rsf-1后的趨勢一致。提示Rsf-1可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的
　　討論
　　在卵巢癌、乳腺癌和頭頸部癌中存在11q13.5的擴(kuò)增。已報道，

17、11q13.5包含幾個候選的癌基因，包括Rsf-1，EMSY，PAK1，TAOS1，Rad9，CCND1，F(xiàn)GF3，和FGF4。在肺癌中也存在著11q13的擴(kuò)增。已證實卵巢癌、鼻咽癌、膽囊癌和口腔鱗癌中Rsf-1基因擴(kuò)增且與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)Rsf-1在肺癌中過表達(dá)，并且能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。然而，Rsf-1對細(xì)胞的遷移侵襲能力的影響及可能的機(jī)制未見報道。
　　本研究證實了Rsf-1的過

18、表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。干擾Rsf-1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯抑制了肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。提示Rsf-1能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　大量的數(shù)據(jù)證明染色質(zhì)重塑在腫瘤的發(fā)生中也有一定作用，然而他們在腫瘤進(jìn)展中的確切機(jī)制還不清楚。有研究報道，在Rsf-1高表達(dá)的卵巢癌中Rsf-1激活A(yù)TM依賴的DNA損傷反應(yīng)增加染色質(zhì)的不穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)干擾Rsf-1能夠在一定程度上下調(diào)MMP-2表達(dá)。MMP-2對細(xì)胞外基質(zhì)的降

19、解和細(xì)胞的侵襲能力有重要作用[12-16]，因此Rsf-1可通過對MMP-2的調(diào)節(jié)來影響肺癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　在各種血液和實體惡性腫瘤中NF-κB信號通路失調(diào)。NF-κB信號通路的激活通過促進(jìn)增殖，增強(qiáng)細(xì)胞存活，促進(jìn)血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移參與致瘤過程。蛋白相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明AKT、ERK和NF-κB信號通路活性可能受Rsf-1蛋白調(diào)控。在卵巢癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rsf-1可明顯增強(qiáng)依賴NF-κB的基因的表達(dá)和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。因此在干擾

20、Rsf-1后我們檢測了NF-κB通路活性，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)的NF-κB減少。提示Rsf-1可能激活NF-κB信號通路。癌癥相關(guān)的NF-κB依賴的基因包括編碼細(xì)胞因子和趨化因子（如TNF-α，IL1，IL8，MCP-1），增值相關(guān)蛋白（如cyclinD1），抗凋亡蛋白（如Bcl-2，Bcl-XL，IAP），浸潤和血管生成相關(guān)蛋白（如MMP，VEGF）。NF-κB依賴的MMP-2下調(diào)是S100A4抑制腎癌細(xì)胞遷移侵襲所必須。我們進(jìn)一步應(yīng)用NF-κB

21、通路抑制劑BAY11-7082處理H460和H1299細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MMP-2的蛋白水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，與干擾Rsf-1后的趨勢一致。提示Rsf-可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的。
　　綜上所述，本研究證實了Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌中呈過表達(dá)，并且其過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，下調(diào)Rsf-1表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。Rsf-1可能通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)，影