人源DNA聚合酶δ最小亞基p12在細(xì)胞凋亡過(guò)程中降解途徑分析.pdf

1、人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由四亞基組成的異源四聚體，其中p125為催化大亞基，其它三個(gè)較小亞基分別為p50、p68和p12，而p12通常又被稱(chēng)為第四亞基或最小亞基。研究表明，DNA聚合酶δ不僅在DNA復(fù)制過(guò)程中扮演重要的角色，同時(shí)還參與多種形式的DNA損傷修復(fù)，在維持細(xì)胞周期的正常調(diào)節(jié)以保證基因組結(jié)構(gòu)的完整性和遺傳的穩(wěn)定性等方面具有特殊的重要意義。
　　動(dòng)物細(xì)胞對(duì)DNA的損傷響應(yīng)(DNA damage response，DD

2、R)主要是通過(guò)宿主的保護(hù)機(jī)制來(lái)完成，所有的保護(hù)機(jī)制均涉及到相關(guān)蛋白復(fù)合體的裝配和各種DNA損傷響應(yīng)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)激活，包括一系列的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活和DNA修復(fù)機(jī)制的響應(yīng)以及細(xì)胞是否進(jìn)入到程控凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而保證其遺傳信息的完整性。近期研究表明，Polδ也受到DDR的調(diào)控。體外培養(yǎng)的人源細(xì)胞通過(guò)遺傳毒物處理或射線(xiàn)誘導(dǎo)而引起DNA損傷的情況下，細(xì)胞內(nèi)Polδ由原來(lái)的四聚體全酶形式Polδ4轉(zhuǎn)換為三聚體Polδ3以應(yīng)對(duì)DNA損傷。轉(zhuǎn)換后的三聚體

3、Polδ3比Polδ4具有更強(qiáng)的糾正引物和模板上錯(cuò)誤核苷酸的能力。因此，Polδ3被認(rèn)為是DNA損傷后Polδ的主要活性形式，它可以參與到DNA修復(fù)過(guò)程中完成缺口的填補(bǔ)以及S-期細(xì)胞的跨損傷合成過(guò)程中。在跨損傷合成聚合酶轉(zhuǎn)換的模型中，Polδ3作為轉(zhuǎn)換過(guò)程中Polδ的主要形式，通過(guò)Polη/ub-PCNA/Polδ3復(fù)合體共同完成兩種聚合酶之間的迅速轉(zhuǎn)換。進(jìn)一步的研究表明，p12亞基是通過(guò)ATR通路調(diào)控下以泛素化依賴(lài)的形式降解，在此過(guò)程

4、中UbcH5c和RNF8作為一組E2/E3發(fā)揮重要作用，由RNF8介導(dǎo)的p12亞基降解使得Polδ4變成Polδ3，這一過(guò)程是細(xì)胞應(yīng)對(duì)DNA損傷響應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。但是，如果DNA耐損傷途徑不能夠及時(shí)完成DNA損傷的修復(fù)過(guò)程，DNA的復(fù)制叉就會(huì)崩塌，形成錯(cuò)誤的復(fù)制叉結(jié)構(gòu)，染色體受到損害或缺失，最后細(xì)胞將進(jìn)入到程控凋亡途徑中。那么，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，p12亞基及其他三個(gè)亞基將會(huì)如何應(yīng)對(duì)？如果p12亞基確實(shí)發(fā)生了蛋白酶解，Polδ其他亞基如何

5、參與這個(gè)過(guò)程？Polδ4到Polδ3是如何轉(zhuǎn)換的？但到目前為止，還沒(méi)有任何關(guān)于Polδ參與細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)的研究報(bào)道。
　　因此，本論文研究通過(guò)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑或相關(guān)誘導(dǎo)藥物等處理宮頸癌細(xì)胞(HeLa-S3)，運(yùn)用Western Blot、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、鈣蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、熒光顯微鏡等分析手段和工具，觀(guān)察Polδ各亞基在不同凋亡途徑中凋亡早期和凋亡晚期的特征變化，首次探索DNA聚合酶δ在

6、細(xì)胞凋亡途徑中的未知功能。
　　其初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鈣離子誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡過(guò)程中，p12亞基在凋亡早期首先被酶解，在中期又發(fā)生回復(fù)，而在凋亡晚期再次被酶解，具有明顯的時(shí)相性;p12亞基在凋亡早期的蛋白酶解可以被蛋白酶抑制劑MG132阻斷，而MG132和Calpain抑制劑ALLN可以同時(shí)抑制p12亞基在凋亡晚期的降解。體外實(shí)驗(yàn)表明，Calpain是通過(guò)和Polδ的p125、p68、p50三個(gè)亞基及PCNA捆綁反應(yīng)酶解p12