DNA聚合酶β在人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系中的作用及其機(jī)理的研究.pdf

1、資料表明，肺癌是導(dǎo)致死亡的主要腫瘤類型之一，并且有上升趨勢。肺癌常分為兩種類型：小細(xì)胞肺癌(small cell lung canccr, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。其中NSCLC是肺癌中常見的類型，大約占肺癌發(fā)生率的80％，而且診斷時(shí)往往己經(jīng)處于晚期。隨著化療藥物的發(fā)展，紫杉醇(Paclitaxel)己經(jīng)證明在治療晚期NSCLC中具有顯著的抗腫瘤活性。但是獲得性耐藥

2、的出現(xiàn)，極大地限制了NSCLC的有效治療。 紫杉醇是從紫杉樹皮中提取到的一種新型抗微管藥物，其廣泛的抗瘤譜和確切的療效己經(jīng)得到人們普遍的認(rèn)同，目前主要用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤等。紫杉醇耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚不清楚，可能與多種機(jī)制有關(guān)。 DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，DNA polβ)廣泛分布于哺乳類細(xì)胞中，是真核細(xì)胞主要的DNA損傷修復(fù)基因，其DNA序列高度保守

3、，為一看家基因。DNA polβ的主要功能是參與DNA的堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)。其表達(dá)水平在整個(gè)細(xì)胞周期中相對(duì)穩(wěn)定且不受細(xì)胞周期增殖調(diào)控。許多研究者在耐藥腫瘤組織發(fā)現(xiàn)了DNA polβ的過表達(dá)，DN A pol β的過表達(dá)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加, 使細(xì)胞獲得突變表型，可能是介導(dǎo)腫瘤發(fā)生耐藥的重要分子機(jī)制。有關(guān)DNA polβ在人肺腺癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)以及其與多藥耐藥產(chǎn)生的關(guān)系的研究，國內(nèi)外尚

4、未見報(bào)道。 腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是影響腫瘤化療臨床療效的主要障礙之一。探討：MDR產(chǎn)生機(jī)制、尋找克服腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)成為化療藥物發(fā)展的方向。體外建立多藥耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥機(jī)制的重要手段，也是篩選新型耐藥逆轉(zhuǎn)劑的工具和方法。 本研究首先采用逐步間歇增加劑量法，以紫杉醇為誘導(dǎo)藥物，經(jīng)過180d的誘導(dǎo)，建立了A549多藥耐藥細(xì)胞株-A549/TXL20，并對(duì)耐藥

5、細(xì)胞株進(jìn)行了初步的生物學(xué)特性鑒定。接著，本文檢測了A549/TXL20和A549細(xì)胞株中的DNApolβ及其相關(guān)耐藥基因的Mrna表達(dá)水平；然后，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，成功構(gòu)建了DNA pol β靶向siRNA真核表達(dá)載體；最后，將DNA polβ靶向siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549/TXL20細(xì)胞株，觀察了其對(duì)A549/TXL20耐藥逆轉(zhuǎn)的作用，并探討了其耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。 第一部分紫杉醇誘導(dǎo)人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系的

6、建立及其生物學(xué)特征 方法 1．以紫杉醇(Paclitaxel為誘導(dǎo)藥物，人肺腺癌細(xì)胞系(A549)為誘導(dǎo)對(duì)象，采用逐步間歇增加紫杉醇藥物濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，建立多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20。 2．采用MTT法檢測A549/TXL20耐藥指數(shù)，并同時(shí)對(duì)順鉑、長春新堿、5-氟脲嘧啶和絲裂霉素4種藥物進(jìn)行交叉耐藥檢測。 3．采用細(xì)胞克隆形成法測定A549/TXL20對(duì)紫杉醇的敏感性。 4．采用高效液相色

7、譜測定細(xì)胞內(nèi)紫杉醇的濃度。 第二部分人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20和人肺腺癌細(xì)胞系 A549中DNA pol β及相關(guān)耐藥基因的表達(dá) 方法 1．提取人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20細(xì)胞及人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中的總RNA，通用引物逆轉(zhuǎn)錄出Cdna； 2．以β-actin為內(nèi)參照，對(duì)細(xì)胞的DNA polβ、mdrl、GST-π、mrpl、lrp及topo Ⅱ基因進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增

8、；分析A549/TXL20及A549細(xì)胞中這些基因的相對(duì)表達(dá)水平。 3．Western blot檢測A549/TXL20及A549細(xì)胞系DNA polβ蛋白表達(dá)水平4．應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用方差分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以p<0.05為差異有顯著意義。 第三部分 DNA polβ靶向SiRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定方法 1．D

9、NApol β基因靶向的編碼短發(fā)卡樣siRNA的單鏈DNA模板的設(shè)計(jì)及合成。 2．單鏈DNA模板的退火處理及純化。 3．加A處理，構(gòu)建TA克隆及重組體的篩選和鑒定。 4．亞克隆入pslience2.0-GFP載體及重組體的篩選和鑒定。 結(jié)果 1．基于DNA pol β Mrna序列設(shè)計(jì)合成了2對(duì)編碼小干擾RNA(siRNA)的單鏈DNA模板，并成功構(gòu)建了DNA pol β靶向性siRNA真核表達(dá)載

10、體pslience2.0-GFP-sipolbl。 2．基于DNA pol β Mrna序列設(shè)計(jì)合成了2對(duì)編碼小干擾RNA(siRNA)的單鏈DNA模板，并成功構(gòu)建了DNA pol β靶向性siRNA真核表達(dá)載體pslience2.0-GFP-sipolb2。 3．基于DNA pol β Mrna序列設(shè)計(jì)合成了2對(duì)編碼小干擾RNA(siRNA)的單鏈DNA模板，并成功構(gòu)建了DNA pol β對(duì)照siRNA真核表達(dá)載體ps

11、lience 2.0-GFP-SC。 第四部分重組DNA polβ靶向Sirna表達(dá)載體對(duì)人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制的研究 方法 1．利用脂質(zhì)體包裹將構(gòu)建的DNA pol β靶向siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20，G418篩選，得到穩(wěn)定沉默DNApolβ表達(dá)的轉(zhuǎn)入DNApol β靶向siRNA的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20細(xì)胞株

12、。 2．采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染DNA polβ靶向siRNA對(duì)A549/TXL20對(duì)紫杉醇和順鉑的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。 3．裸鼠腋窩皮下注射轉(zhuǎn)染后的A549/TXL20細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的A549/TXL20，建立裸鼠移植瘤模型，觀察DNA polβ靶向siRNA對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20移植瘤耐藥性的作用。 4．半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中DNA pol β、mdrl、GST-π及mrp1基因的Mrna表達(dá)

13、。 5．Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中DNA polβ的蛋白表達(dá)水平。 6．體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變?cè)囼?yàn)測定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因自發(fā)突變率。 7．應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用方差分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為差異有顯著意義。 結(jié)論 1．經(jīng)過180d紫杉醇的誘導(dǎo)，成功地建立了相對(duì)穩(wěn)定的人肺腺癌多

14、藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20，該細(xì)胞系對(duì)順鉑、絲裂霉素、氟尿嘧啶和長春新堿有交叉耐藥性，可用于多藥耐藥性機(jī)制及耐藥逆轉(zhuǎn)的研究。 2．首次揭示人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20中DNA polβ基因的Mrna表達(dá)水平和蛋白表達(dá)均顯著高于親本A549細(xì)胞，表明DNA polβ基因的過表達(dá)可能參與了A549/TXL20細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生。 3．A549/TXL20細(xì)胞存在mdr 1、GST-π、mrp1及l(fā)rp基因

15、的高表達(dá)，topo Ⅱ基因沒有明顯變化。提示mdr 1、GST-π、mrpl及l(fā)rp的過表達(dá)亦可能參與了A549/TXL20細(xì)胞多藥耐藥的發(fā)生。 4．成功構(gòu)建2個(gè)DNA pol β靶向siRNA表達(dá)載體pslience2.0-GFP-sipolbl和pslience2.0-GFP-sipolb2，并成功轉(zhuǎn)染人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/TXL20，可顯著沉默細(xì)胞中DNA pol β基因的表達(dá)。 5．DNA pol β靶

16、向siRNA體外實(shí)驗(yàn)?zāi)茱@著逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇和順鉑的耐藥性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可顯著降低裸鼠耐藥肺癌移植瘤的腫瘤生長率。 6．DNA pol β靶向siRNA能顯著降低A549/TXL20細(xì)胞中的DNA polβ和mdrl的Mrna的表達(dá)和降低DNApol β的蛋白表達(dá)，并能顯著降低其自發(fā)突變率。 7．綜合研究結(jié)果顯示：采用逐步間歇增加藥物濃度法，用紫杉醇成功誘導(dǎo)出相對(duì)穩(wěn)定的人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞AS49/TXL20，其耐藥機(jī)制可