棉花棕色纖維基因Lc1的圖位克隆及原花色素合成和纖維棕色呈色的調(diào)控.pdf

1、彩色棉是一種能在纖維發(fā)育過(guò)程中合成和積累色素且成熟纖維具有天然色彩的棉花材料，是天然彩色纖維的主要來(lái)源。彩色棉由于具有天然色彩，在紡織加工過(guò)程中不需要漂白和印染處理，極大的減少了紡織加工的能耗水耗，同時(shí)也避免了紡織品中有機(jī)染料和無(wú)機(jī)離子殘留對(duì)人體的傷害。近年來(lái)，隨著人們的環(huán)保意識(shí)和綠色消費(fèi)觀念的增強(qiáng)，天然彩色棉及其紡織品越來(lái)越受到消費(fèi)者們的青睞。但天然彩棉存在的產(chǎn)量低、品質(zhì)差、色澤單一等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了我國(guó)彩棉產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展。
　

2、　棕色棉是目前應(yīng)用最廣泛的一類彩色棉。研究表明，深棕色纖維的顏色受Lc1控制，棕色棉纖維中的棕色色素是類黃酮家族的原花色素(PA，Proanthocyanidins)。但未見(jiàn)成功克隆出Lc1的報(bào)道，且棕色纖維中PA合成的調(diào)控機(jī)制也尚不清楚。揭示棉花纖維色素合成及纖維呈色的調(diào)控機(jī)理，可以為彩色棉的纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的改良提供理論依據(jù)，對(duì)推動(dòng)我國(guó)彩棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重大意義。
　　在高等植物中，PA的合成主要由MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄

3、因子形成的三元復(fù)合體共同調(diào)控。在擬南芥棕色種皮中，參與調(diào)控PA合成的這三類轉(zhuǎn)錄因子分別是TT2、TT8和 TTG1。其中，TT2在擬南芥種皮的PA合成中起決定性作用，它能單獨(dú)激活下游PA結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。TT8是擬南芥 bHLH第三(Шf)亞家族的轉(zhuǎn)錄因子，與TT2共同作用時(shí)，可顯著增強(qiáng)對(duì)下游靶標(biāo)基因的激活效應(yīng)。
　　為研究棉花PA合成和纖維呈色的調(diào)控機(jī)理，本論文全面鑒定了棉花TT2和TT8同源基因，通過(guò)表達(dá)分析、棉花轉(zhuǎn)基因、煙草瞬

4、時(shí)表達(dá)，以及棕色纖維基因(Lc1)的精細(xì)定位，揭示了棉花TT2和TT8同源基因與棕色纖維PA合成和纖維棕色呈色的關(guān)系。主要結(jié)果如下：
　　1.棉花TT2同源基因的克隆、表達(dá)分析及功能驗(yàn)證
　　以擬南芥TT2氨基酸序列為探針，在雷蒙德氏棉的基因組中共找到21個(gè)相似蛋白。進(jìn)化分析表明，其中5個(gè)蛋白(Gorai.001G015200、Gorai.010G087200、Gorai.001G020600、Gorai.001G02040

5、0和Gorai.001G020500)與擬南芥TT2聚為一簇，可能是棉花的TT2同源蛋白，將5個(gè)棉花TT2同源蛋白分別命名為GrTT2-1～5。從陸地棉 T586的A、D亞基因組中克隆出5對(duì)棉花TT2同源基因(GhTT2s，分別是GhTT2-1A/D、GhTT2-2A/D、GhTT2-3A/D、GhTT2-4A/D、GhTT2-5A/D)。序列分析表明來(lái)源于不同亞基因組的同對(duì)基因(直系同源)序列高度相似，旁系同源基因間的序列差異較大。<

6、br>　　為驗(yàn)證這5對(duì)GhTT2同源基因的功能，將D亞基因組中的4個(gè)GhTT2s(GhTT2-1D～5D，除GhTT2-3D)及GhTT2-3A構(gòu)建在組成型啟動(dòng)子(35S)的下游，并對(duì)白色棉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，這些轉(zhuǎn)基因棉花的愈傷組織均能被PA的特異染色劑DMACA染成藍(lán)色，其愈傷組織中PA的含量約是野生型的5-10倍。以上結(jié)果表明，克隆的5對(duì)棉花GhTT2s基因都有促進(jìn)PA合成的功能。
　　通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)這10個(gè)

7、GhTT2s在白色和棕色陸地棉的各組織及不同發(fā)育時(shí)期纖維中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，有2對(duì)GhTT2s(GhTT2-1A/D和GhTT2-2A/D)在兩種棉花各組織中的表達(dá)模式相似，主要在胚珠中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。有2對(duì)GhTT2s(GhTT2-3A/D和 GhTT2-4A/D)主要在兩種棉花材料的特定組織中表達(dá)。GhTT2-3A只在棕色棉的纖維中高水平表達(dá)，而GhTT2-3D主要在白色棉的胚珠中表達(dá)；GhTT2-4A主要在棕色棉的花瓣中表達(dá)，GhT

8、T2-4D主要在白色棉的葉片中表達(dá)。而GhTT2-5A/D在兩種棉花的各組織中均檢測(cè)不到表達(dá)信號(hào)。在纖維發(fā)育的過(guò)程中，除GhTT2-3A外，其它9個(gè)GhTT2同源基因幾乎都無(wú)表達(dá)信號(hào)。GhTT2-3A在棕色棉纖維發(fā)育的不同時(shí)期均有高水平表達(dá)，同時(shí)纖維中有大量的PA合成和積累。這些結(jié)果表明，棕色陸地棉中的10個(gè)GhTT2同源基因在其各組織中的表達(dá)模式不同。
　　進(jìn)一步檢測(cè)這10個(gè)基因在RIL群體的棕色纖維和白色纖維中的表達(dá)，結(jié)果表明

9、GhTT2-3A無(wú)論是在棕色纖維總cDNA池及各個(gè)單株中均有高水平的表達(dá)，而在白色纖維中則不表達(dá)，其它9個(gè)GhTT2同源基因在這兩種棉花纖維中也都未檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)。這些結(jié)果表明，GhTT2-3A的表達(dá)與棕色纖維共分離，可能參與纖維中棕色色素合成的調(diào)控。
　　2.GhTT2-3A是棕色纖維Lc1的候選基因
　　前期研究表明，深棕色纖維基因(Lc1)能上調(diào)整個(gè)PA的合成途徑，并促進(jìn)棕色纖維呈色。為明確GhTT2-3A和Lc1及纖

10、維棕色呈色的關(guān)系，我們利用兩個(gè)分離群體對(duì)Lc1進(jìn)行了精細(xì)定位分析。從T586的BAC文庫(kù)中篩選出一個(gè)GhTT2-3A-BAC序列，并在此基礎(chǔ)上尋找Lc1連鎖的分子標(biāo)記。根據(jù)TT2-3A-BAC和相應(yīng)D基因組序列，設(shè)計(jì)SSR引物，篩選出Lc-FT3和Lc08兩個(gè)差異顯著標(biāo)記。進(jìn)一步比較親本T586和渝棉1號(hào)的差異序列并設(shè)計(jì)標(biāo)記引物，最終篩選出PHDA、MSF10-3Y、TT2-3A3Y、TT2-4A、ERE和Pec53l這6個(gè)差異顯著的標(biāo)

11、記。同時(shí)以棕色棉T586和白色棉渝棉1號(hào)為親本建立含有270個(gè)系的RIL群體和1698株的F2代放大群體。用8個(gè)標(biāo)記引物在兩個(gè)遺傳群中對(duì)GhTT2-3A和Lc1進(jìn)行精細(xì)定位。結(jié)果表明，在RIL群體中Lc1位于標(biāo)記MSF10A-3Y和Pec53l間，遺傳距離為0.3cM。在F2代群體中，Lc1位于遺傳標(biāo)記TT2-3A3Y和TT2-4A間，兩標(biāo)記的遺傳距離為0.7cM，實(shí)際距離約47kb，含有GhTT2-3A和GhTT2-5A2個(gè)基因。綜合

12、上述的表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證結(jié)果，推測(cè)GhTT2-3A是棕色纖維Lc1的候選基因，可能參與棕色纖維的色素合成和棕色呈色。
　　3.纖維次生壁合成時(shí)期表達(dá)GhTT2-3A是轉(zhuǎn)基因成熟纖維呈色的關(guān)鍵
　　為明確 GhTT2-3A在棉花纖維PA合成中的調(diào)控作用，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法對(duì)GhTT2-3A進(jìn)行了功能分析。分別將GhTT2-3A構(gòu)建在不同發(fā)育時(shí)期的纖維特異啟動(dòng)子 SCFP、E6、FbL2A和組成型啟動(dòng)子35S的下游，利用農(nóng)桿菌

13、介導(dǎo)法對(duì)白色棉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明GhTT2-3A在 SCFP::GhTT2-3A、E6::GhTT2-3A和35S::GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)育早期(11DPA)的纖維中表達(dá)水平明顯提高，同時(shí)纖維中PA含量也比野生型增加1-2倍。但在發(fā)育后期(22DPA)的纖維中，GhTT2-3A的表達(dá)明顯下降到幾乎和野生型中一樣的水平，且轉(zhuǎn)基因纖維中的PA含量也和野生型中無(wú)明顯差異。這些轉(zhuǎn)基因的成熟纖維最終呈現(xiàn)出和野生型一樣的白色。而FbL

14、2A::GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花則相反，其成熟纖維為明顯棕色。GhTT2-3A在 FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)育早期(11DPA)纖維中幾乎不表達(dá)，纖維中的PA含量較野生型中也無(wú)變化，而在次生壁合成時(shí)期，GhTT2-3A在纖維中的表達(dá)水平逐漸提高，PA在纖維中合成和積累量也明顯增加。這些結(jié)果表明，GhTT2-3A在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中有促進(jìn)PA合成的功能，且在纖維發(fā)育的后期(次生壁合成期)合成和積累PA是成熟纖維顯色的關(guān)鍵

15、。
　　為明確GhTT2-3A上調(diào)表達(dá)對(duì)其它基因的影響，對(duì)FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花和Null系(對(duì)照，GUS陰性)22DPA的纖維進(jìn)行了mRNA數(shù)字表達(dá)譜分析。結(jié)果表明，與Null系相比，轉(zhuǎn)基因棉花纖維中共有170個(gè)表達(dá)差異的基因，包含149個(gè)上調(diào)基因和21個(gè)下調(diào)基因?？偣灿?7個(gè)PA合成途徑基因被鑒定出，這些基因的表達(dá)都明顯上調(diào)，包含5個(gè)GhPAL、4個(gè)GhC4H、2個(gè)Gh4CL、5個(gè)GhCHS、4個(gè)GhCHI、

16、3個(gè)GhF3H、4個(gè)GhF3’H、4個(gè)GhF3’5’H、2個(gè)GhDFR、3個(gè)GhLAR、2個(gè) GhANS和2個(gè) GhANR。進(jìn)一步的RT-PCR驗(yàn)證表明這些基因在FbL2A::GhTT2-3A轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達(dá)水平都明顯高于 Null系。此外，2個(gè)GhWD40和1個(gè)GhTT8同源基因也都上調(diào)了3倍以上。這些結(jié)果表明GhTT2-3A能上調(diào)轉(zhuǎn)基因纖維中的整個(gè)PA合成途徑，同時(shí)對(duì)參與PA調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子也有一定的激活作用。
　　以上研

17、究表明，GhTT2-3A能通過(guò)激活整個(gè)PA合成途徑促進(jìn)PA在轉(zhuǎn)基因纖維中合成和積累，最終使成熟纖維呈現(xiàn)出明顯的棕色。同時(shí)根據(jù)前期的表達(dá)和遺傳定位分析，認(rèn)為GhTT2-3A與控制棕色色素PA合成的棕色纖維基因Lc1是同一基因。
　　4.棉花TT8同源基因的鑒定和克隆
　　基于前面的研究，為尋找棉花中與PA調(diào)控相關(guān)的TT8同源基因，通過(guò)在已測(cè)序的二倍體棉花(亞洲棉和雷蒙德氏棉)中尋找bHLH的同源基因，最終鑒定出289個(gè)棉花bH

18、LH相關(guān)的同源基因，并命名為GobHLH001-289。與擬南芥、可可中的bHLH蛋白及一些蘚類和藻類中的部分bHLH蛋白的進(jìn)化分析，共分為30個(gè)亞家族，而棉花中的bHLH蛋白被分成27個(gè)亞家族。這些 bHLH蛋白中，S5a和S5b亞家族和擬南芥第三(Шf)亞家族中參與類黃酮調(diào)控的bHLH(如TT8)蛋白的序列相似性最高。這些bHLH的基因編號(hào)分別為GobHLH062、GobHLH064、GobHLH110、GobHLH123和GobH

19、LH130。
　　為明確S5a和S5b亞家族的bHLH基因結(jié)構(gòu)，克隆和比較了陸地棉(A、D亞基因組)和它們的祖先二倍體棉(A和D基因組)中所有的S5a和S5b亞家族基因。結(jié)果表明，來(lái)自二倍體A和D基因組中的10個(gè)S5a和S5b亞家族bHLH基因在四倍體棉花中都有保留。其中四倍體棉中有兩個(gè)序列的發(fā)生改變，主要是GhbHLH130D中有一個(gè)15bp序列的刪除和GhbHLH062A中有一個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列的插入。
　　5.GhTT2

20、-3A和GhbHLH110A對(duì) PA途徑的激活具有協(xié)同作用
　　為明確GhTT2-3A和bHLH在棉花 PA合成途徑中的調(diào)控方式，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和雙熒光活性檢測(cè)的方法，檢測(cè)GhTT2-3A和GhbHLH110A對(duì)PA合成途徑基因GhDFR、GhLAR和GhANR的啟動(dòng)子激活作用。結(jié)果表明，GhTT2-3A和GhbHLH110A分別都能單獨(dú)激活GhDFR、GhLAR和GhANR啟動(dòng)子的表達(dá)，但激活效應(yīng)均較弱。當(dāng)GhTT2-3A

21、和GhbHLH110A二者共同作用時(shí)，其激活效果明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，在棉花纖維PA的合成中，GhTT2-3A和GhbHLH110A能夠協(xié)同激活PA合成途徑基因。
　　綜上所述，本研究中鑒定出了5對(duì)能促進(jìn)PA合成的棉花GhTT2同源基因。其中，GhTT2-3A在棕色纖維中特異性表達(dá)，且在纖維發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)GhTT2-3A都能促進(jìn)纖維中PA的合成和積累，但只有次生壁合成時(shí)期表達(dá)GhTT2-3A的轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維呈棕色，并獲得