彩色棉纖維比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及花色素還原酶GhANR基因的鑒定.pdf

1、1.研究目的
　　彩色棉是一種成熟吐絮時(shí)纖維自身帶有天然色彩的棉花。近年來(lái),人們的健康和環(huán)保意識(shí)逐漸增強(qiáng),天然彩色棉制品倍受人們青睞。然而,彩色棉纖維的顏色僅有綠色和棕色兩大色系,顏色單調(diào),遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)于絢麗服飾的需求。由于缺乏除棕、綠兩種顏色之外的其他顏色的種質(zhì)資源,通過(guò)常規(guī)的雜交手段難以解決目前彩色棉顏色單調(diào)的問(wèn)題。人們寄希望利用基因工程手段來(lái)改變彩色棉纖維的顏色,完成這項(xiàng)工作的前提是明確彩色棉纖維色素形成的分子機(jī)制。本研

2、究利用2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定分析比較了彩色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組的差異,分離鑒定差異蛋白,為揭示彩色棉色素合成的分子機(jī)制及為利用基因工程手段改良彩色棉纖維色澤品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
　　2.結(jié)果與結(jié)論
　　2.1.利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析比較了棕色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組差異,利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了3個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期(12,18和24DPA)共計(jì)78個(gè)差異蛋白點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)21個(gè)差異蛋

3、白點(diǎn)與植物次生代謝途徑相關(guān),其中15個(gè)參與類黃酮物質(zhì)的合成,且均在棕色纖維中表現(xiàn)上調(diào);DMACA染色實(shí)驗(yàn)以及7個(gè)原花色素合成關(guān)鍵酶基因的qPCR分析表明,類黃酮在棕色棉纖維色素形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用,推測(cè)原花色素與纖維顏色形成有關(guān)。本研究首次從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度明確了類黃酮在棕色棉纖維色素合成過(guò)程中的重要作用,也為類黃酮是棕色纖維中的色素物質(zhì)這一假設(shè)提供了直接的證據(jù)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一些在棕色纖維中下調(diào)的蛋白點(diǎn),包括糖酵解、氧化還原平衡,細(xì)胞骨架

4、和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白,推測(cè)棕色纖維中類黃酮化合物的活躍代謝影響了其它代謝途徑的正常運(yùn)作,一些纖維發(fā)育相關(guān)的蛋白,如ascorbateperoxidase、superoxidedismutase、actin、annexin和heatshockprotein70等表現(xiàn)下調(diào),是棕色棉纖維品質(zhì)差的主要原因。
　　2.2.利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析比較了綠色棉及其白色近等基因系棉纖維蛋白質(zhì)組差異,在3個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期(12,15和24DPA)

5、成功鑒定了25個(gè)差異蛋白點(diǎn)。這些差異蛋白點(diǎn)包括次生代謝、能量/碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成、蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架、氨基酸代謝、細(xì)胞響應(yīng)和脂代謝等相關(guān)蛋白,其中大部分蛋白點(diǎn)表現(xiàn)為下調(diào)。幾個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)分別為phospholipaseD、phenylcoumaranbenzylicetherreductase和s-adenosylmethioninesynthase,暗示它們?cè)诰G色棉色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步尋找綠色纖維中色素合

6、成相關(guān)基因,本研究利用雙向電泳技術(shù)研究了21DPA綠色棉纖維蛋白質(zhì)組,從凝膠上挖取220個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDITOF/TOF分析,成功鑒定出156個(gè)蛋白。根據(jù)蛋白的功能將這些蛋白分成12類,主要包括能量/碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成、氧化還原平衡和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,反映了21DPA綠色棉纖維中的生理活動(dòng)狀態(tài)。根據(jù)差異蛋白質(zhì)組策略和21DPA蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),在綠色纖維中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的色素合成途徑,類黃酮相關(guān)蛋白點(diǎn)在綠色纖維中無(wú)上調(diào)現(xiàn)象,表明綠

7、色纖維中的色素物質(zhì)與棕色纖維不同。
　　2.3.花色素還原酶是合成表兒茶素的關(guān)鍵酶之一,表兒茶素是原花色素的合成單元。利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在棕色棉纖維中明顯上調(diào)的蛋白點(diǎn),質(zhì)譜鑒定為花色素還原酶。根據(jù)GenBank中該蛋白的cDNA序列克隆了GhANR基因,該基因包含1008bp核酸序列,編碼336個(gè)氨基酸殘基。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示GhANR在棕色纖維中的表達(dá)量高于白色棉。將GhANR連接至蛋白表達(dá)載體pET28a