RNA-Seq技術(shù)篩選抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的宿主限制性因子及其抗病毒作用驗(yàn)證.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2006年，我國(guó)出現(xiàn)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic PRRSV，HP

2、-PRRSV)，具有很強(qiáng)的感染力和致病性，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)更大的危害。豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine pulmonary alveolar macrophages，PAMs)是 HP-PRRSV的主要靶細(xì)胞。I型干擾素（Interferon，IFN）具有抑制 PRRSV復(fù)制的能力，而IFN發(fā)揮抗病毒作用主要是依靠干擾素刺激基因（Interferon stimulated genes, ISGs）編碼的宿主限制性因子。尋找抑制 HP-PR

3、RSV復(fù)制的宿主限制性因子已經(jīng)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，但 IFN刺激產(chǎn)生的限制性因子數(shù)量眾多，篩選工作量巨大。RNA-Seq技術(shù)是新一代測(cè)序技術(shù)，具有高通量、效率高、靈敏度好的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)中，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)IFN處理的PAMs中抗HP-PRRSV限制性因子進(jìn)行高通量篩選。
　　將抗PRRSV的限制性因子ISG15作為指示因子，根據(jù)感染PRRSV的PAMs中ISG15的表達(dá)變化，選擇接毒后12小時(shí)作為收樣時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4

4、個(gè)不同處理組，分別為 IFN、IFN+PRRSV、PRRSV和 C（空白對(duì)照組）組。用豬 IFN-α處理 PAMs誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，再感染HP-PRRSV，進(jìn)而用RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)IFN預(yù)處理的PAMs對(duì)HP-PRRSV的應(yīng)答變化。IFN-α處理細(xì)胞共檢測(cè)到346個(gè)上調(diào)的差異性表達(dá)基因(DEGs)，其中有93個(gè)DEGs在HP-PRRSV感染細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下降。富集分析這93個(gè)下降表達(dá)的DEGs，主要分布在免疫應(yīng)答相關(guān)的通路

5、，如“RIG-I樣受體信號(hào)通路”、“病毒應(yīng)答”、“刺激應(yīng)答”。在表達(dá)差異的16個(gè)抗病毒 DGEs中，包括 IRG6(RSAD2)、 IFI44、 ISG20、 PKR、LOC100738990(TRIM5)、BST2、OAS1、 IFIT1(ISG56)、 IRF7、 IFIT2、ISG15、LOC100627004(IFITM1)、 ISG12(A)(IFI27)、IFITM3、IFIT5，其中15個(gè)的表達(dá)可以被HP-PRRSV抑制。

6、
　　為了驗(yàn)證以上16個(gè)抗病毒 DGEs是否具有抑制HP-PRRSV復(fù)制的作用，采用 siRNA干擾技術(shù)下調(diào)其表達(dá)，然后感染 HP-PRRSV，分析病毒復(fù)制水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn) PKR、OAS1、IFIT1(ISG56)、ISG15、IFI44、ISG20、BST2、IRF7、IFIT2、LOC100627004(IFITM1)、IFITM3、 IFIT5和GBP1均能顯著抑制PRRSV的復(fù)制。
　　谷氧還蛋白1（glutared

7、oxin1，GLRX1）是一種具有抗氧化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗凋亡等多功能的蛋白。RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果顯示IFN可以顯著上調(diào)GLRX1的表達(dá)，但HP-PRRSV感染能顯著抑制其表達(dá)。siRNA干擾下調(diào)PAMs中GLRX1的表達(dá)，HP-PRRSV復(fù)制顯著增加，說(shuō)明GLRX1能夠抑制HP-PRRSV的增殖。比較感染PRRSV豬和健康豬的各組織中的GLRX1表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)感染 PRRSV豬腹股溝淋巴結(jié)、心臟、肺門淋巴結(jié)中的 GLRX1表達(dá)量顯著下降