乙型肝炎病毒X蛋白的真核表達及對巨噬細胞分泌功能與凋亡的影響.pdf

1、目的:將乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)X蛋白真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx轉染巨噬細胞,觀察X蛋白在細胞中的表達及其對巨噬細胞分泌細胞因子及凋亡的影響,為進一步研究HBV的致病機制奠定實驗基礎。
　　方法:用Primer5.0軟件分析HBV X基因序列,設計相應特異性引物,聚合酶鏈反應(PCR)擴增465bp的目的基因片段,將其插入pcDNA3.1(+)載體,通過雙酶切分析及測序鑒定篩選陽性

2、重組體;將真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx通過Super FectTM脂轉染試劑轉染巨噬細胞,利用 Western-blotting鑒定X蛋白在巨噬細胞中的表達;細胞轉染質粒后24h,用LPS刺激巨噬細胞,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測pcDNA3.1(+)-HBx轉染的巨噬細胞不同時間(12h、24h、48h)培養(yǎng)上清液中細胞因子TNF-α、IL-1β的含量,統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析所得數(shù)據(jù);通過形態(tài)學方法觀察巨噬細

3、胞,利用顯微計數(shù)法測定X蛋白即時高表達時,地塞米松誘導的細胞凋亡并計算凋亡率,用統(tǒng)計軟件通過方差分析所得數(shù)據(jù)。
　　結果:
　　(1)將PCR擴增的465bp大小的HBV X基因片段,連接入pcDNA3.1(+),雙酶切及測序結果表明X基因亞克隆入pcDNA3.1(+)真核表達載體,即得 X蛋白真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx。
　　(2)將真核表達載體pcDNA3.1(+)-HBx轉染巨噬細胞,Wester

4、n-blotting結果顯示pcDNA3.1(+)-HBx能在巨噬細胞中表達約17KD的目的蛋白。
　　(3)ELISA法測定細胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量,LPS刺激組及pcDNA3.1(+)組與空白對照組有顯著性差異(P<0.01),pcDNA3.1(+)-HBx組與LPS刺激組及pcDNA3.1(+)組有顯著性差異(P<0.01),而LPS刺激組與pcDNA3.1(+)組無顯著性差異(P>0.05),即LPS可活化

5、巨噬細胞分泌細胞因子,且X蛋白即時高表達可引起LPS誘導的巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β明顯增加。
　　(4)地塞米松誘導的巨噬細胞凋亡所得數(shù)據(jù)進行方差分析,地塞米松刺激組及pcDNA3.1(+)組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05),pcDNA3.1(+)-HBx組與pcDNA3.1(+)組及地塞米松刺激組有顯著性差異(P<0.05),而地塞米松刺激組與pcDNA3.1(+)組無顯著性差異(P>0.05),即地塞米松能高