塵螨的培養(yǎng)以及重組塵螨二類變應(yīng)原的活性研究.pdf

1、目的：分離培養(yǎng)上海地區(qū)粉塵螨和戶塵螨，獲得不同編碼序列的重組塵螨二類變應(yīng)原，并探討其應(yīng)用價(jià)值。 方法：從過敏性疾病患者床褥采集分離粉塵螨和戶塵螨，控制培養(yǎng)溫度在25±2~C，濕度75％，采用混合培養(yǎng)基和封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行初步培養(yǎng)。在體視鏡和生物顯微鏡下對(duì)成年螨的形態(tài)進(jìn)行鑒定，并選用核糖體DNA(rDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)進(jìn)行分子鑒定，雙重鑒定確認(rèn)螨種后即可進(jìn)入大量培養(yǎng)。從成功的塵螨培養(yǎng)系統(tǒng)中分離單個(gè)孕螨進(jìn)行隔離培養(yǎng)，

2、獲得純種的塵螨種群。 用RT-PCR的方法擴(kuò)增粉塵螨和戶塵螨二類(Derf2和Derp2)編碼基因，插入原核表達(dá)載體pET-19b，在大腸桿菌BL21(DE3)plysS內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，所獲得的重組蛋白用點(diǎn)印跡(DotBlot)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)其與鼠單抗及人群血清IgG的反應(yīng)性；另用重組抗原免疫小鼠，用ELISA法檢測(cè)鼠多抗與重組二類變應(yīng)原抗原和天然塵螨粗抗原的反應(yīng)性。 結(jié)果：采集分離粉塵螨和戶塵螨，成

3、功建立戶塵螨培養(yǎng)系統(tǒng)，對(duì)塵螨種群進(jìn)行“克隆化’’培養(yǎng)。獲得14個(gè)戶塵螨二類變應(yīng)原(Derp2)基因核苷酸多樣性位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的兩個(gè)重組變應(yīng)原(rDerp2-I，rDer2-III)與鼠單抗7Al親和力相似，而與鼠單抗1D8的親和力不同，與上海地區(qū)人群IgG結(jié)合力相似(r=0．8526)；獲得17個(gè)粉塵螨二類變應(yīng)原(Derf2)基因核苷酸多樣性位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的兩個(gè)重組蛋白(rDerf2-I，rDerf2-V)對(duì)鼠單抗1D8和7Al的親和力相似，與