空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應(yīng)原的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景:變態(tài)反應(yīng)疾病(過敏性疾病)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，世界各國變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率高達(dá)10-30％。近些年來其發(fā)病率在逐步增高。在引起過敏性疾病眾多吸入性變應(yīng)原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的最重要因素。與過敏性疾病有關(guān)的塵螨主要為屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus，Derp)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae，Derf)。它們喜好在溫暖、潮濕環(huán)境中

2、繁衍，以人或動(dòng)物的皮屑、指甲及毛發(fā)為主要食物，多藏匿于床褥、枕頭、地毯、衣服、毛絨玩具或家具內(nèi)。 隨著社會(huì)生活水平的提高，空調(diào)已成為城市家庭的必備電器，且人們?cè)诿芊饪照{(diào)環(huán)境內(nèi)工作、生活和學(xué)習(xí)時(shí)間越來越長(zhǎng)。本課題組在前期研究過程中，偶然發(fā)現(xiàn)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中存在大量的塵螨?？照{(diào)濾網(wǎng)灰塵是否也是塵螨嗜好的棲居場(chǎng)所之一及其季節(jié)消長(zhǎng)規(guī)律和分布規(guī)律、該塵螨變應(yīng)原(即塵螨的分泌物、排泄物以及死亡降解產(chǎn)物)是否經(jīng)空調(diào)送風(fēng)而排入室內(nèi)空氣中，國內(nèi)外目

3、前尚未見報(bào)道。 國外已有以酶聯(lián)免疫方法開發(fā)的商品化的檢測(cè)塵螨主要變應(yīng)原的試劑盒供應(yīng)，但存在價(jià)格昂貴(約五百英磅一盒)，在國內(nèi)沒有代理點(diǎn)等問題而未能在我國廣泛應(yīng)用。在國內(nèi)尚未見對(duì)于定量檢測(cè)塵螨變應(yīng)原含量方法學(xué)研究的報(bào)道。研究目的 1.探討空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨的季節(jié)性消長(zhǎng)規(guī)律和分布地域性差異，為進(jìn)一步預(yù)防過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎等)和防螨空調(diào)的研制提供理論依據(jù)。 2.探討空調(diào)濾網(wǎng)中塵螨變應(yīng)原與哮喘發(fā)病的關(guān)系，為哮

4、喘患者制定防螨措施做好變應(yīng)原回避提供重要的參考依據(jù)。 3.建立檢測(cè)環(huán)境中屋塵螨2組變應(yīng)原(Derp2)含量的雙抗體夾心ELISA法。研究?jī)?nèi)容與方法于2004年8月份在北京、上海、南昌、廣州、深圳五個(gè)城市，用隨機(jī)抽樣方法選擇319臺(tái)家庭空調(diào)(北京48臺(tái)，上海55臺(tái)，南昌72臺(tái)，廣州60臺(tái)，深圳84臺(tái))，進(jìn)行空調(diào)濾網(wǎng)灰塵的采集，稱重后在解剖鏡下對(duì)灰塵中塵螨進(jìn)行計(jì)數(shù)、封片，在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。其中深圳地區(qū)進(jìn)行為期一年(2004年7

5、月至2005年6月)的實(shí)驗(yàn)，共采集了232份樣品。用IndoorBiotechnologies公司的試劑盒對(duì)采集回來的空調(diào)濾網(wǎng)灰塵樣品進(jìn)行塵螨主要變應(yīng)原(屋塵螨1組變應(yīng)原(Derp1)、粉塵螨1組變應(yīng)原(Derf1)和塵螨2組變應(yīng)原(Der2)的定量檢測(cè)。采集廣州地區(qū)30例哮喘患者和30例正常家庭臥室空調(diào)開機(jī)前后空氣中的灰塵及空調(diào)濾網(wǎng)灰塵，采用IndoorBiotechnologies公司的試劑盒檢測(cè)其Derf1、Derp1和Der2的

6、濃度。以終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside，IPTG)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存重組子BL21star/pET24a/Derp2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到的蛋白經(jīng)Ni-NAT純化后梯度透析復(fù)性。采用塵螨過敏病人血清進(jìn)行蛋白印跡(Western-Blotting)檢測(cè)。用純化后的重組Derp2蛋白(rDerp2)免疫新西蘭兔得到抗Derp2多克隆血清，經(jīng)檢驗(yàn)合格后用飽和硫酸銨(

7、NH4)2SO4進(jìn)行鹽析沉淀，脫鹽后以70mmol/LPH6.3的PB對(duì)DEAE-SepharoseF.F陰離子交換層析柱進(jìn)行純化，再用過碘酸鈉氧化法進(jìn)行辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，此酶標(biāo)抗體為雙抗體夾心法的檢測(cè)抗體。用DMEM培養(yǎng)Derp2單克隆抗體，用ProteinA親和層析柱純化，作為捕獲抗體。用棋盤滴定法測(cè)定包被抗體的最佳濃度及酶結(jié)合物的最佳稀釋度而建立檢測(cè)Derp2的雙抗體夾心ELISA方法。 研究結(jié)果1.空調(diào)濾網(wǎng)灰

8、塵中存在塵螨變應(yīng)原，其分布有明顯的季節(jié)性特征，每年最早在3月份即可出現(xiàn)，7、8月份達(dá)高峰，11月份消失。 2.廣州、深圳地區(qū)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵以粉塵螨為主，屋塵螨次之；南昌、上海地區(qū)空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中屋塵螨比粉塵螨略多；北京地區(qū)沒有檢出螨蟲。 3.廣州地區(qū)家庭空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中Derp1、Derf1和Der2濃度分別為0.84±0.74、3.17±2.01、2.91±2.14ug/g灰塵，深圳地區(qū)分別為1.68±1.31、3.14±2

9、.75、2.75±1.82ug/g灰塵，南昌地區(qū)分別為3.51±2.39、1.91±1.30、2.25±1.78ug/g灰塵，上海地區(qū)分別為3.09±2.10、1.62±1.58、2.40±1.88ug/g灰塵。四個(gè)城市家庭空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中的Der2、廣州與深圳地區(qū)的Derf1、上海與南昌地區(qū)的Derp1含量均高于引起塵螨過敏性疾病致敏的閾值2μg/g灰塵。4.哮喘患者家庭空調(diào)開機(jī)前空氣中Derp1、Derf1和Der2的濃度分別為0.2

10、3±0.07，2.62±1.08，0.92±0.41ng/m3，開機(jī)后三者的濃度分別為0.49±0.25，3.73±1.22，1.35±0.81ng/m3，三者的濃度開機(jī)前后相比差別均有顯著性意義(P＜0.05)；正常家庭哮空調(diào)開機(jī)前空氣中Derp1、Derf1和Der2的濃度分別為0.33±0.19，5.21±2.36，2.77±1.16ng/m3，開機(jī)后三者的濃度分別為0.48±0.23，7.18±3.33，4.18±1.61ng/

11、m3，三者的濃度開機(jī)前后相比差別均有顯著性意義(P＜0.05)。5.棋盤滴定法顯示包被用的Derp2單克隆抗體最佳工作濃度為1ug/ml，HRP標(biāo)記的抗Derp2多克隆抗體的最佳稀釋度為1∶1000。建立的雙抗體夾心法檢測(cè)極限為2ng/ml，與參考標(biāo)準(zhǔn)方法相比，特異性為0.876，敏感性為0.900，準(zhǔn)確性為0.886，χ2檢驗(yàn)得P＞0.05，新建立的雙抗體夾心ELISA方法與參考標(biāo)準(zhǔn)方法檢出率無差別。 結(jié)論1.首次證實(shí)空調(diào)濾網(wǎng)

12、灰塵中存在塵螨變應(yīng)原，并有明顯的季節(jié)消長(zhǎng)規(guī)律和地區(qū)分布特征，優(yōu)勢(shì)螨種是粉塵螨與屋塵螨。 2.空調(diào)濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應(yīng)原隨空調(diào)送風(fēng)而排入室內(nèi)空氣中?？照{(diào)是室內(nèi)塵螨變應(yīng)原的重要來源之一，其濾網(wǎng)灰塵中塵螨變應(yīng)原的存在是引起過敏性疾病的重要誘因之一。 3.國內(nèi)首次制備出Derp2多克隆抗體；成功培養(yǎng)出Derp2單克隆抗體。 4.建立了檢測(cè)塵螨Derp2變應(yīng)原的雙抗體夾心法ELISA法。該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，可