枇杷花期調(diào)控的分子生物學(xué)研究.pdf

1、枇杷(Eriobotrya Lindl.)為薔薇科枇杷屬植物，該屬包含二三十種，不同種間花期差異明顯，并且有一些枇杷種類的花期是可變的，或稱可塑的。例如，普通枇杷在秋冬季節(jié)開花；臺灣枇杷為春季開花；而臺灣枇杷恒春變型在原產(chǎn)地臺灣春季開花，引種到廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)枇杷種質(zhì)資源圃以及廣州市果樹所后卻變?yōu)榍锒_花。然而，迄今為止，關(guān)于枇杷花期的分子生物學(xué)方面的研究甚少，并且未見涉及野生枇杷及花期差異的研究。本研究一方面從枇杷成花的基礎(chǔ)方面入手，

2、進行了枇杷花期相關(guān)基因的克隆、表達分析和功能驗證的初步探索；另一方面對花期不同的枇杷屬材料花芽分化前及花芽分化期間的葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，深入研究枇杷花芽分化起始過程中基因轉(zhuǎn)錄的動態(tài)變化，為花期調(diào)控的分子生物學(xué)研究提供了大量信息，希望為揭示枇杷花期調(diào)控的分子機理奠定基礎(chǔ)，為生產(chǎn)實踐中人工調(diào)控花果發(fā)育，以及培育不同成熟期新品種提供理論依據(jù)，并為其它木本果樹的成花機理研究提供借鑒。主要結(jié)果如下：
　　(1)對兩種不同花期野生枇杷臺灣枇杷

3、(E.deflexaNakai)和臺灣枇杷恒春變型(E.deflexa f.koshunensis Nakai)的莖頂端進行切片觀察，結(jié)果顯示臺灣枇杷恒春變型在9月底至10月初就已經(jīng)開始花芽分化，而臺灣枇杷11月才開始，表明不同枇杷種或變型之間花期不同是因為它們花芽分化開始的時間即已有不同。同時對普通枇杷開花時間不同的兩個品種‘早鐘6號’和‘解放鐘’的莖頂端在不同發(fā)育階段的觀察，發(fā)現(xiàn)‘早鐘6號’和‘解放鐘’開花時間差異則不是因為花芽分化

4、起始時間的不同，而主要是因為它們花序發(fā)育快慢不同。
　　(2)從臺灣枇杷恒春變型中成功得到FT、CO、GI、SOC1和PIF4同源基因各一個，及FD和SVP同源基因各兩個，分別命名為EdFT、EdCO、EdGI、EdSOC1、EdPIF4、EdFD1、EdFD2、EdSVP1和EdSVP2。對這些基因預(yù)測的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，表明它們都具有各基因所特有的保守氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域。
　　(3)亞細胞定位顯示EdFT、E

5、dSVP1和EdSVP2在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，而EdFD1、EdFD2、EdCO、EdGI、EdSOC1和EdPIF4只定位于細胞核。
　　(4)在擬南芥中過表達EdFT、EdFD1、EdFD2、EdCO、EdGI和EdSOC1均表現(xiàn)出早花表型，說明它們具有保守的促進開花的功能。晝夜節(jié)律表達分析表明EdGI、EdCO和EdFT的表達均隨晝夜變化而變化，受光周期影響。BiFC實驗證明EdFT可以和EdFD1/2在體內(nèi)發(fā)生蛋白水

6、平上的互作。這些都進一步證明這些基因是擬南芥相應(yīng)基因的同源基因，可能具有類似的功能。
　　(5)時空表達分析發(fā)現(xiàn)，EdFD1、EdFD2和EdSOC1可能對臺灣枇杷恒春變型花芽分化起正調(diào)控作用，EdSVP1起負調(diào)控作用；而在普通枇杷‘解放鐘’和‘早鐘6號’中，除了EdFD1和EdSOC1，EdCO和EdFT可能也對花芽分化起正調(diào)控作用，而EdFD2卻沒有明顯影響。
　　(6)對臺灣枇杷和臺灣枇杷恒春變型花芽分化前及花芽分化期

7、間的葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，總計產(chǎn)出74314777320 nt數(shù)據(jù)，組裝得到總unigene116674個。共有94459個unigene獲得注釋信息。注釋結(jié)果有39221個unigene匹配到COG分類的25個功能類別，有66514個unigene注釋到GO類別的55個功能組。共預(yù)測得到CDS88481條。這為枇杷花期調(diào)控進一步研究提供了豐富的序列和生物學(xué)信息。
　　(7)差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)不同樣品間差異表達基因數(shù)量較多。采用W

8、GCNA構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了28個模塊。對lightcyan模塊進行KEGG功能分析，發(fā)現(xiàn)該模塊顯著富集的代謝途徑包括：晝夜節(jié)律－植物，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，苯丙氨酸代謝，次生代謝物生物合成，倍半萜和三萜生物合成，苯丙烷生物合成，類胡蘿卜素生物合成，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。其中植物晝夜節(jié)律和類胡蘿卜素生物合成代謝通路可能在枇杷花期調(diào)控中起重要作用，為后續(xù)功能和調(diào)控機制研究打開通道。
　　(8)與擬南芥開花相關(guān)基因進行同源