2型糖尿病家系中高甘油三酯血癥患者脂蛋白脂酶基因突變及功能分析.pdf

1、本項研究包括三部分：1.2型糖尿病家系中高甘油三酯血癥患者脂蛋白脂酶基因分子篩查 目的：對成都地區(qū)漢族人群2型糖尿病(T2DM)家系中伴高甘油三酯血癥(HTG)患者進(jìn)行脂蛋白脂酶(LPL)基因分子篩查。方法：選取成都地區(qū)漢族人群中符合入選條件的T2DM家系，從T2DM家系中選擇TG≥2.25mmol/L的患者進(jìn)行LPL基因分子篩查，53人符合此標(biāo)準(zhǔn)，其中T2DM患者31人，糖耐量減低者(IGT)11人，糖耐量正常(NGT)者11

2、人，這53人共代表了26個T2DM家系，TG范圍在2.3-13.0mmol/L。正常對照118例。用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)和聚合酶鏈反應(yīng)-變性高效液相色譜(PCR-DHPLC)對LPL基因進(jìn)行突變檢測，然后對檢出的突變位點通過DNA序列分析進(jìn)一步證實，對發(fā)現(xiàn)突變位點的家系成員進(jìn)行篩查，同時在正常群體中篩查這些突變位點的頻率。對所有研究對象均進(jìn)行血糖、血脂和胰島素測定，計算體重指數(shù)(BMI)。 結(jié)果：1.

3、在LPL基因外顯子檢測到7種突變，分別是：Ala71Thr、Val108Val、Leu286Pro、Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu。其中Lys312insC、Thr361insA和Leu376Leu是本研究中新發(fā)現(xiàn)的突變位點，以前從未報道過。 2.對新發(fā)現(xiàn)的Lys312insC和Thr361insA突變位點在家系成員中進(jìn)行進(jìn)一步篩查，結(jié)果顯示8＃家系同時攜帶了Asn291Ser

4、和Lys312insC突變，這兩突變相互間有協(xié)同效應(yīng)，并與家系中HTG呈共分離現(xiàn)象。在14＃及28＃家系中均發(fā)現(xiàn)了Thr361insA突變，通過家系內(nèi)關(guān)聯(lián)分析顯示Thr361insA突變與家系中HTG呈顯著相關(guān)。上述突變均未在正常對照中檢測到。 3.在新1＃和新3＃家系的先證者中篩查到了Leu286Pro和Ala71Thr突變，其中新1＃家系的先證者是一位39歲男性，其TG為11.9mmol/L；新3＃家系的先證者為一位40歲的

5、男性，其TG為13.0mmol/L，由于Leu286Pro和Ala71Thr突變曾經(jīng)被報道過，并且均進(jìn)行了體內(nèi)及體外的功能研究，顯示這兩者突變均可以導(dǎo)致其產(chǎn)物L(fēng)PL活性缺乏，從而使血中TG極度升高。因此考慮Leu286Pro和Ala71Thr突變是這兩個家系成員HTG的直接原因。 結(jié)論：在成都地區(qū)漢族人群T2DM家系中伴HTG患者LPL基因的突變頻率較高；部分家系的HTG是由于LPL基因突變直接導(dǎo)致的。 2.野生型人LP

6、LcDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆和鑒定 目的：獲取野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒，為下一步進(jìn)行LPL基因的體外定點突變及體外表達(dá)提供一個必要條件。 方法：逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法從人的大網(wǎng)膜脂肪組織獲取人LPLcDNA基因，選用pcDNA3.1Zeo(+)質(zhì)粒作為載體，運(yùn)用基因克隆技術(shù)構(gòu)建野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒；對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切、PCR以及雙向測序鑒定。 結(jié)果：經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切及PC

7、R鑒定證實LPL基因已克隆到pcDNA3.1Zeo(+)質(zhì)粒中，DNA雙向測序證實與基因庫中LPL基因的序列完全一致。 結(jié)論：成功構(gòu)建了野生型人LPLcDNA重組質(zhì)粒，為下一步進(jìn)行LPL基因的體外定點突變及體外表達(dá)奠定了實驗基礎(chǔ)。 3.LPL基因的體外定點突變及體外表達(dá) 目的：對LPL基因進(jìn)行Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC定點突變；同時在體

8、外研究這四個突變LPL基因的功能。 方法：采用定點突變試劑盒對LPL基因進(jìn)行體外定點突變；采用了陽性脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA質(zhì)粒導(dǎo)入COS-1細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)分7組：空白對照組即不給予任何干預(yù)，陰性對照組即用空質(zhì)粒pcDNA3.1Zeo(+)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，陽性對照組即用野生型重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染和四個實驗組即分別用4個突變型重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)基LPL濃度

9、的檢測采用的是人LPLELISA試劑盒；細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)基LPL活性的檢測采用的是分光光度計法。 結(jié)果：1.通過DNA雙向測序證實，除導(dǎo)入的特異突變位點外無其它新的突變產(chǎn)生。突變的pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.用RT-PCR法對細(xì)胞裂解液及培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果示：除空白及陰性對照孔未擴(kuò)增出條帶外，其余各組均擴(kuò)增出一條特異性條帶，其片段大小為1455bp，說明野生型及突變型重組質(zhì)粒

10、pcDNA3.1Zeo(+)-LPL基因在真核COS-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功。 3.對各組細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)基LPL濃度的檢測，結(jié)果顯示：在細(xì)胞裂解液中，野生型LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞LPL濃度為298±14ng/ml，四組突變的LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞LPL濃度有輕度下降趨勢，但與野生型組相比，均未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義；在細(xì)胞培養(yǎng)基中，野生型LPL轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞培養(yǎng)基LPL濃度為277±7ng/ml，四組突變的LPL轉(zhuǎn)染的CO

11、S-1細(xì)胞培養(yǎng)基LPL濃度顯著下降，與野生型組相比，均達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)意義。 4.對各組細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)基LPL活性的檢測，結(jié)果顯示：在細(xì)胞裂解液及細(xì)胞培養(yǎng)基中，野生型轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞LPL活性分別為1.69±0.03和1.47±0.02FFAumol/ml·h；相對于野生型來說，無論是細(xì)胞裂解液還是細(xì)胞培養(yǎng)基中，四組突變組的LPL活性均發(fā)生了顯著的降低，其中在Asn291Ser+Lys312insC組未檢測到LPL活性，T

12、hr361insA組LPL活性約為野生型的20％，Lys312insC組LPL活性約為野生型的12％以及Asn291Ser組LPL活性約為野生型的60％。 結(jié)論：成功地完成了LPL基因的體外定點突變；LPL的Asn291Ser、Lys312insC、Thr361insA及Asn291Ser+Lys312insC四種突變均沒有影響到LPL的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但在不同程度上都影響到了LPL向細(xì)胞外的分泌，且都顯著降低了LPL的活性，四個突