內(nèi)皮祖細(xì)胞三維血管新生模型的建立及其特性分析.pdf

1、目的：隨著血管組織工程技術(shù)的不斷完善，內(nèi)皮祖細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用也引起了研究者的重視?，F(xiàn)階段應(yīng)用于臨床的組織工程材料包括異體血管、人工合成材料和自體血管。異體血管移植存在嚴(yán)重的免疫反應(yīng)；人工血管生物相容性較好，免疫反應(yīng)低，但是缺乏內(nèi)膜，容易發(fā)生血栓，尤其是小口徑血管(<6 mm)移植失敗率高；自體血管則受到血管功能條件限制，往往不能滿足移植需求。而實驗證明內(nèi)皮祖細(xì)胞能參與新生血管的形成，具有高增殖能力以及和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞有著相似的特

2、性，而且取材方便，因此是組織工程血管、血管移植物再內(nèi)皮化以及構(gòu)建組織工程器官血管網(wǎng)絡(luò)種子細(xì)胞的理想來源。但目前對內(nèi)皮祖細(xì)胞的定性、分化及發(fā)育機(jī)制仍不清楚，而且平面培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞雖然能形成類似毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，但其不符合體內(nèi)的生長環(huán)境，其生物學(xué)特性在人體內(nèi)也有很大差異。近年來三維基質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其在骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)等方面的應(yīng)用解決了這一難題。 基于此，設(shè)計了本試驗來觀察大鼠外周血及骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，對培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞

3、進(jìn)行表面標(biāo)記和功能檢測，同時建立三維立體模型，立體觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生中的作用，同時對模型進(jìn)行分析進(jìn)一步了解細(xì)胞培養(yǎng)后有何生物學(xué)作用，并與平面培養(yǎng)相比較，為內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管新生及組織工程中的廣泛應(yīng)用提供試驗性理論基礎(chǔ)。 方法： 1．分別取大鼠外周血和骨髓，加M199等倍稀釋并混勻。沿管壁緩慢加入裝有Ficoll分離液(1.073g/ml)的50m1離心管中。2000r/min×30 min密度梯度離心后將中間的白霧層

4、吸出并置入另一短中管中，加入5倍以上體積的M199，以1300 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞兩次。末次離心后，棄上清，加入M199重懸細(xì)胞。取1滴細(xì)胞懸液與1滴2.0g/L臺盼藍(lán)染液混合，滴于血球計數(shù)板上，計數(shù)4個大方格內(nèi)細(xì)胞的總數(shù)。以1×106/L的密度接種于加有M199完全培養(yǎng)液的預(yù)涂纖連蛋白的培養(yǎng)皿中，置37℃、50％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液，將未貼壁細(xì)胞棄之。此后每隔3 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞飽和后用胰酶消化備

5、用。 2．冰上將膠原液4ml與0.5ml10×M199培養(yǎng)液、0.5ml1mol/LNaOH在10ml試管中混勻，將之加入24孔培養(yǎng)板上，每孔加入0.3ml。置入37℃、50％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，待凝固后取出，表面分別加入上述從外周血和骨髓中消化下來的細(xì)胞并補(bǔ)足完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合至70％-80％時添加另一層膠原，對照組培養(yǎng)液中不含VEGF。 3．觀察因子誘導(dǎo)下三維模型的新生芽數(shù)變化并對三維模型進(jìn)行

6、鑒定。 結(jié)果： 1．骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞在數(shù)量及生長速度上均大于外周血來源，二者均表達(dá)Ⅷ因子和CD133。CD133在第七天左右表達(dá)高峰，隨后表達(dá)逐漸消弱，Ⅷ因子表達(dá)率逐漸增高。證明了所培養(yǎng)細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2．內(nèi)皮祖細(xì)胞在以Ⅰ型膠原為主的三維基質(zhì)內(nèi)分別從上、下兩個方向向膠原基質(zhì)內(nèi)生長，24 h內(nèi)即可出現(xiàn)向膠原內(nèi)的出芽及浸潤。隨著時間的推移，逐漸形成垂直于膠原基底面的分支樣結(jié)構(gòu)，并相互交織成網(wǎng)。對照組細(xì)胞生長慢

7、，出芽慢，管狀結(jié)構(gòu)細(xì)小，向膠原內(nèi)浸潤的深度淺，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀疏，不完整。血管數(shù)在第9天前逐漸增加，隨后未見增加并出現(xiàn)部分萎縮。 3．VEGF實驗組與對照組新生血管數(shù)目對比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，VEGF能動員和誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)血管新生。 結(jié)論： 1．骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞在數(shù)量及分化生長速度上均大于外周血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，功能上均表達(dá)CD133和Ⅷ因子，形態(tài)上無明顯差異。 2．鼠尾膠原凝膠可以為內(nèi)皮祖