PSGL-1過表達內皮祖細胞移植促進缺血組織血管新生的實驗研究.pdf

1、下肢缺血性疾病多由動脈粥樣硬化所致的動脈狹窄或閉塞引起，其最早及最常見的癥狀為間歇性跛行，嚴重者會出現(xiàn)缺血性靜息痛、足趾缺血性潰瘍和壞疽，甚至導致截肢。隨著生活水平日益提高，下肢缺血性疾病的發(fā)病率亦逐年升高，嚴重的影響著人們的生活質量。
　　 近年來，內皮祖細胞移植促進血管新生技術為患者治療嚴重下肢缺血性疾病提供了一種新途徑。內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是血管內皮細胞的前體細胞，在

2、胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生。但是近些年的研究發(fā)現(xiàn)，由于體內病理生理環(huán)境的影響，注射入體內的EPC只有很少一部分聚集到缺血部位發(fā)揮作用，因此，如何通過各種措施增加EPC歸巢的數量已經成為目前研究的焦點。
　　 P選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）是九十年代初發(fā)現(xiàn)的一種粘附分子，具有同源二聚體的結構，是一種分子量為120KD的跨膜糖蛋白，表達于

3、多種白細胞的表面，如中性粒細胞，單核細胞，淋巴細胞等。PSGL-1與P選擇素的相互作用在介導細胞初始粘附過程中有重要作用。本研究試圖探討將PSGL-1轉染到EPC后觀察PSGL-1在EPC中的過表達是否有助于進一步促進EPC的血管新生作用，為EPC在促進血管新生和治療缺血性疾病的臨床應用方面提供新的研究線索。
　　 一、P選擇素糖蛋白配體-1重組腺病毒載體的構建。將人P選擇素糖蛋白配體-1的cDNA亞克隆至穿梭質粒pDC316，

4、用脂質體轉染法將AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質粒pBHGlox-E1，3Cre和穿梭質粒pDC316-PSGL-1共轉染人HEK293細胞，進行同源重組并包裝擴增病毒。經酶切鑒定及PCR結果證明PSGL-1基因重組腺病毒載體構建成功，測序結果表明所的目的基因為PSGL-1，用HEK293細胞包裝后，重組腺病毒的滴度為3.1x1011PFU/ml。在第一部分實驗中成功應用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)成功地構建了人P選擇素糖蛋白配體-1重組腺

5、病毒載體。
　　 二、腺病毒介導PSGL-1體外感染EPC的實驗研究。在這一部分中我們體外原代培養(yǎng)大鼠骨髓EPC，并通過形態(tài)學和FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙吞噬實驗鑒定內皮祖細胞，用攜帶PSGL-1基因的腺病毒真核載體（Ad-PSGL-1-CMV-GFP）轉染第七天的EPC，并設空白對照組，流式細胞儀檢測轉染后第2天綠色熒光蛋白（GFP）的表達率。FITC-UEA-I和DiI-acLDL熒光雙染證實分化的EPCs，

6、以MOI為100感染各組細胞24h后，熒光顯微鏡觀察轉染效率可達75％以上，未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡，RT-PCR和Western，免疫熒光可證實腺病毒介導的PSGL-1的基因和蛋白質在EPC中的表達明顯高于對照組，PSGL-1過表達可增強內皮祖細胞對活化內皮細胞的粘附性。通過腺病毒介導的方法基因修飾EPC初步認為細胞損傷小，轉染效率高，體外PSGL-1感染EPC增加了EPC與受損傷內皮細胞的粘附，為進一步在體內實驗奠定了基礎。

7、
　　 三、Ad-PSGL-1-EPC對裸鼠缺血下肢血管新生的影響。建立裸鼠下肢缺血模型，術后48小時觀察造模足否成功；在體外通過腺病毒感染的方法介導人PSGL-1基因（Ad-PSGL-1）入EPC，經尾靜脈將Ad-PSGL-1-EPC注入下肢缺血的裸鼠；14天后通過CD31免疫組織化學的方法計算毛細血管形成的數目；激光多普勒測定下肢血流的恢復情況。結果發(fā)現(xiàn)裸鼠左下肢股動脈部分結扎切除術后48小時造成下肢缺血，經尾靜脈移植異種A