活版印刷DNA芯片原位合成新方法及新基材研究.pdf

1、DNA芯片作為一種高通量DNA分析檢測手段，在基因表達(dá)、疾病診斷、藥物篩選等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。目前，DNA芯片發(fā)展有兩大趨勢：其一是以Affymetrix公司為代表的向高密度基因芯片發(fā)展，爭取把人類所有基因探針都固定在一塊芯片上，其發(fā)展將對(duì)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究起到革命性的推動(dòng)，并有可能在將來引發(fā)新的革命；另一種發(fā)展是以Nanogen公司為代表的過程集成化趨勢，由于在實(shí)際臨床診斷及軍事、司法應(yīng)用中，大多數(shù)情況下并不需要高密度的DNA芯片，而是

2、要求便攜式、靈活、速度快和成本低，因此，發(fā)展這種高集成、中低密度的DNA芯片可以在近幾年進(jìn)入市場并發(fā)揮社會(huì)效益。隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及功能基因組研究的深入，要求對(duì)大量的基因信息進(jìn)行高靈敏度、高特異性、定量化的檢測。這對(duì)DNA芯片技術(shù)提出了挑戰(zhàn)，同時(shí)也為DNA芯片技術(shù)的發(fā)展提供了機(jī)遇。 然而，基因芯片的制備還存在著成本高、合成效率低等缺陷。例如，探針數(shù)量稍高傳統(tǒng)的基因芯片價(jià)格在￥150，000(US$1，220)to￥350

3、，000之間，價(jià)格十分昂貴；Affymetrix’s特有的光脫保護(hù)原位合成方法需要制作一系列特定的光掩模，成本高，不適合小批量需求，并且對(duì)不同的用戶需求和不同的基因芯片必須重新設(shè)計(jì)光掩模。尚有待于完善，為此，我們提出了一種中、低密度DNA芯片原位合成方法—活版印刷法，它完全屏棄原位合成中煩瑣而昂貴的掩模制備過程及點(diǎn)樣法中昂貴的探針修飾或標(biāo)記，而是應(yīng)用納米微通道管狀纖維載體材料按照預(yù)先設(shè)計(jì)的探針，排列組合成所需的一系列快速印刷母版，每一張

4、母版對(duì)應(yīng)于一種合成單體試劑。具有操作簡單、成本低、單步合成產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。 本論文的主要貢獻(xiàn)如下：1.本文提出了一種適合于制備活版印刷法原位合成基因芯片的片基的方法——在0.01mol/LNaOH/(H2O-CH3OH)的介質(zhì)中水解微孔尼龍6膜，使其表面漏出活性氨基，然后直接用于DNA原位合成，可得到一種中、低密度原位合成基因芯片新片基。紅外光譜和光電子能譜表征結(jié)果表明：在尼龍6膜表面形成了大量氨基；紫外光譜優(yōu)化了水解條件：pH值

5、為12、水解回流時(shí)間36小時(shí)、甲醇催化；該水解膜連接到391-DNA合成儀上，按照一定的程序合成5’-AACCACCAAACACAC-3’探針，收集每一步脫除的DMT溶液，測其紫外光譜，可計(jì)算其偶聯(lián)效率大于98％。 2.使用低溫等離子體處理技術(shù)，制備了第二種適合于活版印刷法原位合成基因芯片的片基——以H2和N2混合氣體等離子體處理了聚丙烯微孔膜，采用掃描電鏡觀察了處理前后膜的形貌變化；真空全反射紅外光譜和X射線光電子能譜證實(shí)在其

6、表面接枝了大量活性氨基；用紫外光譜定量計(jì)算得知，所接枝的氨基濃度大約為0.5μmol/cm2。該改性膜可直接用于DNA的原位合成，其合成的DNA探針密度遠(yuǎn)高于功能化玻璃片基的探針密度，并可得到98％以上的偶聯(lián)效率。 3.本論文分別采用氫氣/氮?dú)?、氨氣和氧氣三種不同氣氛的等離子體處理了聚丙烯片基，然后分別進(jìn)行寡核苷酸原位合成。光電子能譜(XPS)證實(shí)了在其表面分別接枝了大量氨基和羥基。熒光掃描分析了在三種方法處理的聚丙烯片基上合成

7、的寡核苷酸與靶序列雜交的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明：三種方法處理的聚丙烯片基都可用于DNA原位合成，但從處理工藝和熒光分析結(jié)果來看，均以氮?dú)?氫氣等離子體處理的聚丙烯片基最佳。 4.本文將微流體裝置連接到391DNA合成儀上，在H2/N2等離子體處理的聚四氟乙烯表面直接原位合成了四條DNA探針，通過與熒光標(biāo)記的靶序列雜交后，得到了一個(gè)32個(gè)點(diǎn)陣的寡核苷酸陣列。X射線光電子能譜證實(shí)了經(jīng)等離子體處理的聚四氟乙烯表面接枝大量活性氨基；熒光掃描

8、分析比較了在等離子處理的聚四氟乙烯片基上合成的四條寡核苷酸序列與靶序列雜交后的熒光強(qiáng)度，其互補(bǔ)序列(S1)、錯(cuò)配1、2和3個(gè)堿基的序列(S2S3S4)的熒光強(qiáng)度比值為117.8：78.4：13.89：7.97.結(jié)果表明：以H2和N2混合氣體等離子體處理的聚四氟乙烯可以直接用于寡核苷酸原位合成，且具有很好的雜交特異性，有望成為一類高密度基因芯片新型片基。 5.本文研究了活版印刷法DNA芯片制備原理與工藝流程：探討了寡核苷酸的壓印原

9、理、固相合成方法以及手動(dòng)活版印刷法DNA芯片制備設(shè)備，從反應(yīng)池模具設(shè)計(jì)、纖維管的選擇及合成工藝都做了詳細(xì)描述。并對(duì)活版印刷法寡核苷酸原位合成條件進(jìn)行了優(yōu)化：對(duì)合成中各試劑的性質(zhì)及其對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響；封閉試劑對(duì)寡核苷酸偶聯(lián)效率的影響；四唑和核苷酸單體混合液的反應(yīng)活性等因素進(jìn)行了詳細(xì)的探討。通過上述工藝的研究，我們成功地應(yīng)用活版印刷技術(shù)制備出了16個(gè)和160個(gè)位點(diǎn)的寡核酸陣列的芯片，各陣點(diǎn)上寡核苷酸的雜交熒光強(qiáng)度基本一致；通過與靶序列雜交，