用于制備糖芯片新方法的研究.pdf

1、研究背景：近十年來(lái)，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到細(xì)胞表面糖鏈與蛋白質(zhì)的相互作用促進(jìn)了細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，參與了脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育。這種與糖鏈相互作用的蛋白被稱(chēng)為糖結(jié)合蛋白(glycan.binding protein，GBP)。GBP通過(guò)和糖蛋白糖鏈或糖脂糖鏈的相互作用調(diào)控細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳遞、細(xì)胞內(nèi)吞以及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等生物學(xué)行為。腫瘤發(fā)生時(shí)，蛋白質(zhì)和脂分子糖基化的異常導(dǎo)致糖鏈發(fā)生了結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，相應(yīng)地和這些糖鏈相互作用的GBP的表達(dá)也發(fā)生異

2、常改變。GBP在生物學(xué)進(jìn)程中扮演著十分重要的角色。但是目前仍然缺乏簡(jiǎn)便并能夠用于糖鏈與蛋白質(zhì)之間相互識(shí)別、相互作用的高通量研究方法。特別是缺乏類(lèi)似于DNA芯片和蛋白質(zhì)芯片的研究工具，如與此相類(lèi)似的糖芯片的研究，目前國(guó)際上仍處于探索階段。糖芯片技術(shù)平臺(tái)的建立將為高通量研究蛋白質(zhì)與糖鏈作用的關(guān)系提供有效的工具。 研究目的：研究制備糖芯片的新技術(shù)；建立糖芯片應(yīng)用平臺(tái)體系，應(yīng)用于糖鏈與蛋白質(zhì)之間相互識(shí)別、相互作用的研究。 實(shí)

3、驗(yàn)方法：采用了兩種方法來(lái)制備羥基衍生化的玻片，通過(guò)糖鏈還原末端的半縮醛基與玻片表面的羥基形成糖苷鍵使糖鏈共價(jià)固定在玻片的表面：首先，玻片分別被環(huán)氧化和氨基化，然后用不同的表面化學(xué)修飾方法使玻片表面羥基化。利用羥基衍生化的玻片制備出糖芯片。 研究結(jié)果：開(kāi)發(fā)出了一種新的便捷有效的方法來(lái)制備糖芯片，即利用了糖鏈的還原末端，以糖苷鍵的形式共價(jià)偶聯(lián)其到羥基(.0H)衍生化的玻片上，較好模擬了糖鏈在細(xì)胞表面的天然存在狀態(tài)，生物活性穩(wěn)定。這

4、種制備糖芯片的新技術(shù)固定糖鏈的共價(jià)連接方式簡(jiǎn)單、快速、成本較低、實(shí)用。 1.利用羥基化的玻片表面制備出了糖芯片，熒光標(biāo)記的凝集素可以與糖芯片上固定的糖鏈特異性地結(jié)合，用于檢測(cè)糖鏈在玻片上的固定效果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了4.羥基丁酸肼作為偶聯(lián)劑修飾環(huán)氧化玻片，使玻片表面羥基化。優(yōu)化了糖芯片技術(shù)平臺(tái)的體系，確定了最佳的實(shí)驗(yàn)條件： a.最佳點(diǎn)樣液是醋酸鈉緩沖液。 b.最佳封閉劑是3％Top Block。 c.

5、最佳孵育液是中性或者弱堿性的磷酸鹽緩沖液。 d.最佳孵育時(shí)間為一個(gè)小時(shí)，最佳孵育溫度為4℃。 e.最佳點(diǎn)樣濃度為1 mmolA。 f.糖芯片儲(chǔ)存條件為4℃。 2.應(yīng)用所建立的糖芯片技術(shù)平臺(tái)體系研究了肝臟相關(guān)糖結(jié)合蛋白，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究肝臟相關(guān)糖結(jié)合蛋白在不同的發(fā)育階段以及不同樣本中的分布差異以及豐度差異，為進(jìn)一步研究肝臟中糖結(jié)合蛋白奠定了基礎(chǔ)。 3.應(yīng)用所建立的糖芯片技術(shù)平臺(tái)體系對(duì)健康人血清