粉塵螨變應(yīng)原Der f 2的重組表達(dá)及其ELISA分析和豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型中的應(yīng)用.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文粉塵螨變應(yīng)原Derf2的重組表達(dá)及其ELISA分析和豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型中的應(yīng)用姓名：徐楓申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：王建中20070414撿塵蜷童廑熊堡￡￡至的重塑垂壟叢墓在曼墜!曼△筮塹塑鑒鼠童廛絲墨客搓型主鯉堙旦摘要粉塵螨變應(yīng)原Derf2的重組表達(dá)及其在ELISA分析和豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型中的應(yīng)用第一部分粉塵螨變應(yīng)原Derf2的原核表達(dá)和純化目的：建立wtDert2和muDert2蛋白質(zhì)高效表達(dá)和

2、純化的平臺(tái)，制備得到具有天然活性的wtDerf2和XgE低反應(yīng)性的muDerf2。方法：在BL21(DE3)T程菌中以包涵體形式表達(dá)wtDerf2和兩對(duì)二硫鍵缺失的muDerf2蛋白質(zhì)。粗提的包涵體溶解于含有尿素的緩沖液，以SephaerylS100HR柱色譜使rDert2復(fù)性。通過ELISA和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)比較wtDer12、lnuDer1“2與sIgE的反應(yīng)能力。結(jié)果：通過重組的pBV220質(zhì)粒，rDerf2以包涵體形式得到高效表達(dá)。

3、rDerf2過SephacrylS100HR色譜柱后，獲得較好的復(fù)性。ELISA和皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)表明，wtDerf2與患者血清中的sIgE反應(yīng)較強(qiáng)，而muDerf2的反應(yīng)能力明顯降低。結(jié)論：1高效表達(dá)和純化wtDer億和muDer12蛋白質(zhì)的平臺(tái)已建立，表達(dá)的wtDerf2蛋白質(zhì)可以用來診斷和特異性免疫治療過程中變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化。2Cys8Cysl19和Cys73Cys78之間所形成的兩對(duì)二硫鍵對(duì)Derf2與IgE的結(jié)合力有著重要影響。第二

4、部分Dert2重組蛋白應(yīng)用于變應(yīng)性鼻炎患者血清ELISA檢測(cè)目的：以wtDert2作為固相包被抗原，建立間接ELISA法，檢測(cè)常年變應(yīng)性鼻炎患者血清特異性IgE濃度。方法：經(jīng)過皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)證明的24個(gè)粉塵螨反應(yīng)陽性血清和2個(gè)陰性血清作為IgE血清樣本。wtDerf2固相包被酶標(biāo)板，HRP標(biāo)記的抗人IgE單抗作為第二抗體組成測(cè)試系統(tǒng)來分析特異性IgE。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，間接ELISA系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度為O731U／ml。在4IU／ml、12