新疾病外傷后細菌性致死性肉芽腫痤瘡丙酸桿菌腦感染的分子生物學及形態(tài)學證據(jù).pdf

1、引言：
　　1996年，本課題組發(fā)現(xiàn)了一種發(fā)生于面部皮膚外傷愈合后的肉芽腫性疾病，患者晚期均累及腦組織。該病患者主要表現(xiàn)為面部輕重不一的外傷，愈合后出現(xiàn)進行性增大的暗紅色斑塊，后期腦組織受累，主要表現(xiàn)為腦炎，患者全部在1-4年死亡。根據(jù)患者均有外傷史、病理示肉芽腫性炎癥、電鏡下發(fā)現(xiàn)細菌，患者全部死亡等特點，將此疾病命名為：外傷后細菌性致死性肉芽腫(fatal bacterial granuloma after trauma,FBG

2、T)。經(jīng)過十余年對該疾病發(fā)病機制的探索，初步取得了以下進展：1，使用改良培養(yǎng)基在患者皮損組織中成功分離培養(yǎng)出痤瘡丙酸桿菌(propionibacterium acnes,P.acnes)，使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，在皮損及病變腦組織中成功擴增出P.acnes的16SrRNA全序列，由此明確P.acnes為新疾病FBGT的病原菌，明確了患者的死亡原因為P.acnes所致的腦感染。2，依據(jù)FBGT的臨床特點，在大量閱讀文獻的基礎(chǔ)上，提出

3、IAM基因多態(tài)性引起相應(yīng)分子功能的缺陷是FBGT發(fā)病機制的假說，并在一例患者中證實了該假說。3，通過分型鑒定，明確FBGT和尋常痤瘡的病原菌P.acnes絕大部分屬于致病力相對較低的IA亞型。4，在研究P.acnes生物膜(biofilm,BF)形成的過程中發(fā)現(xiàn)P.acnes形成BF后耐藥性顯著升高，解釋了FBGT治療過程中藥敏試驗結(jié)果和臨床療效不符合的現(xiàn)象，并進一步研究了P.acnes在體內(nèi)形成BF的機制。然而，患者腦脊液及病變處腦組

4、織的細菌分離培養(yǎng)一直未能成功，而免疫組化方法未能明確腦內(nèi)是否確實存在細菌，PCR方法成功擴增P.acnes 16S rRNA的研究結(jié)果雖具有一定說服力，但仍難以給出令人信服的腦感染依據(jù)，腦內(nèi)細菌感染的直接證據(jù)成了對該課題進行深入研究的瓶頸。
　　目的：
　　通過分子生物學方法，證明FBGT的腦感染病原體與皮損相同；通過分子生物學結(jié)合形態(tài)學的方法，對FBGT患者的腦損害組織進行病原菌細胞定位，確認FBGT患者的腦感染系繼發(fā)于面

5、部皮損的痤瘡丙酸桿菌感染。
　　方法：
　　1.運用Oligo6.0軟件和在線工具Primer-BLAST針對P.acnes的16S rRNA和脂肪酶(Lipase)編碼序列設(shè)計合成兩套用于巢氏聚合酶鏈式反應(yīng)(nested polymerase chain reaction,nPCR)的特異性引物，優(yōu)化nPCR反應(yīng)體系及條件，以FBGT患者皮損處DNA和病變腦組織處DNA為模板，擴增P.acnes的16SrRNA及Lipas

6、e編碼序列。
　　2.使用nPCR實驗中擴增P.acnes16SrRNA的第二對引物擴增標準菌株，以該目的片段為模板，制備地高辛標記的cRNA探針，通過原位雜交(in situ hybridization,ISH)和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的方法將病原菌mRNA定位于患者的病變腦組織內(nèi)。
　　結(jié)果：
　　1.擴增9份FBGT患者的皮損及病變腦組織中的

7、病原菌序列后發(fā)現(xiàn)：在16SrRNA(PAS)引物組中，使用第一對引物擴增后，除陽性對照外，患者樣本中無明確條帶出現(xiàn)；將產(chǎn)物1：1000稀釋后使用第二對引物進行擴增，其中7份樣本中出現(xiàn)條帶，但清晰度欠佳。將相同DNA模板使用Lipase(LIP)引物進行擴增，第一對引物擴增后，除陽性對照外，9份模版中的8份在目的片段大小處出現(xiàn)了淺條帶，此后稀釋產(chǎn)物，使用第二對引物繼續(xù)擴增，9份從患者中提取的組織DNA樣本均出現(xiàn)了明確均一的目的條帶。同批設(shè)

8、置空白對照，結(jié)果無條帶出現(xiàn)。測序后經(jīng)BLAST比對，明確為P.acnes。
　　2.使用ISH和FISH的方法對FBGT患者腦部液化壞死區(qū)域中P.acnesmRNA進行原位雜交后，可觀察到陽性信號在組織內(nèi)分布廣泛，多位于細胞內(nèi)。經(jīng)核染料DAPI復染后，進一步確認P.acnes的mRNA雜交信號分布于胞內(nèi)，且在部分視野中可見信號存在于多個核細胞中。同批實驗使用正義探針進行原位雜交的患者腦組織中，和反義探針進行原位雜交的正常腦組織內(nèi)均