霉酚酸酯治療常染色體顯性多囊腎病的實驗研究.pdf

1、本文研究了霉酚酸酯治療常染色體顯性多囊腎病的實驗。 (一)MPA對多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。 通過噻唑藍(lán)(MTT)法和5-溴-2脫氧尿苷酶聯(lián)免疫吸附測定(BrdU，ELISA)法觀察MPA處理多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(PKD)的增殖情況；流式細(xì)胞儀技術(shù)測定MPA作用后細(xì)胞周期分布和凋亡率；實時熒光定量PCR(QT-PCR)和蛋白免疫印跡分析(Western blot)的方法檢測MPA對P21CIP/WAF

2、1和CyclinA mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測不同處理組TGF-β 1、MCP-1和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。 結(jié)果表明：MPA對囊腫襯里上皮細(xì)胞具有增殖抑制作用，呈時間和劑量依賴性，其作用不是由于藥物的毒性反應(yīng)，因為在MPA作用過程中細(xì)胞死亡率(5％。細(xì)胞增殖在補(bǔ)充鳥嘌呤核苷酸后得到部分改善，但仍低于對照組P<0.05，表明其抗增殖作用并不完全依賴非競爭性地抑制IMPDH，可能還存在其他作用機(jī)制。而

3、其增殖抑制作用表現(xiàn)為下調(diào)G1/S檢測點的正性調(diào)控子CyclinA和上調(diào)負(fù)性調(diào)控子P21CIP/WAF1使細(xì)胞阻滯于S期；MPA同時還抑制了囊腫襯里上皮細(xì)胞TGF-β1、MCP-1的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。 (二)MPA誘導(dǎo)多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞凋亡及機(jī)制的研究。 分別采用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，AnnexinV+PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測MPA作用后細(xì)胞的凋亡率；應(yīng)用QT-PCR測定BAX、BCL-2、Caspase3凋

4、亡相關(guān)因子mRNA水平及蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。證實MPA能誘導(dǎo)囊腫襯里上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)，MPA可通過下調(diào)Bcl-2/Bax的比值，從而誘導(dǎo)凋亡。 (三)MPA對多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。 1.MPA與P38信號通路。 應(yīng)用ELISA技術(shù)、MTT及Western blot方法證實MPA可劑量依賴性地抑制LPS刺激后囊腫襯里上皮細(xì)胞內(nèi)P38MAP

5、K的活化，同時細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β1、MCP-1、FN及Ⅳ膠原含量降低，細(xì)胞增殖抑制。說明MPA不僅可以通過抑制IMPDH，阻礙細(xì)胞增殖所必需的DNA和RNA合成而發(fā)揮抗增殖作用，而且還可部分地通過P38MAPK信號通路抑制LPS刺激后PKD細(xì)胞的增殖、炎癥及纖維化反應(yīng)。IMPDH抑制劑(如MPA)調(diào)節(jié)MAPK的活化推測可能與受鳥嘌呤核苷酸調(diào)控的小G蛋白有關(guān)。 2.MPA與細(xì)胞內(nèi)NF-кB的活性。 采用凝膠遷移率實

6、驗觀察霉酚酸對LPS刺激后囊腫襯里上皮細(xì)胞NF-KB活力的影響，同時用ELISA法觀察對LPS刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥、纖維化因子的影響。結(jié)果表明PKD細(xì)胞在一股培養(yǎng)條件下即有較低活力的NF-KB，LPS刺激可以顯著激活PKD細(xì)胞的NF-KB的活力，霉酚酸可劑量依賴性的抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞NF-KB的活力，進(jìn)而減少炎癥纖維化因子的分泌。 3.P38MAPK與NF-кB信號通路。 在PKD細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的相互作用應(yīng)用ELI

7、SA技術(shù)、Western blot方法及凝膠遷移率實驗觀察P38MAPK與NF-кB信號通路在PKD細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的相互作用，發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予P38MAPK特異性抑制SB203580可減少對LPS刺激后PKD細(xì)胞中NF-кB的活性，而預(yù)先給予PDTC(NF-кB的特異性抑制劑)，則對LPS刺激后PKD細(xì)胞中p38活性無明顯影響。結(jié)果表明，在LPS引起的PKD細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生中，p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能影響NF-кB/IкB通路，P3

8、8的磷酸化可激活NF-кB的活性，而NF-кB/IкB信號通路的活化并不影響P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此作用共同調(diào)節(jié)著LPS刺激PKD細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞MCP-1和TGF-β的產(chǎn)生。 據(jù)此，推測MPA一方面通過直接抑制NF-кB的活化，另一方面通過抑制p38 MAPK信號通路活化而間接抑制NF-кB的活化，從而在LPS刺激PKD細(xì)胞的反應(yīng)中發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用。 MPA對PKD細(xì)胞表現(xiàn)的抗增殖、促凋亡及抑制炎癥

9、、纖維化因子分泌的作用為體內(nèi)實驗提供了可靠的理論依據(jù)。 進(jìn)一步的體內(nèi)實驗部分，觀察了MMF對Han：SPRD大鼠的療效：實驗將雄性SPRD雜合子大鼠分為對照組及不同劑量組(MMF 20、30、40mg/kg·d)。3周起灌胃給藥，給藥時間12周，評價藥物的有效性和安全性，有效性指標(biāo)包括血壓、24小時尿蛋白定量、尿滲透壓、血清BUN和Cr、腎重/體重、腎臟病理檢查囊腫指數(shù)、纖維化指數(shù)、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤程度及PCNA觀察囊腫增殖；安全

10、性指標(biāo)包括進(jìn)食量、體重、肝功能、血脂、血糖、血常規(guī)、電介質(zhì)、血尿酸、尿尿酸、肝重/體重、脾重/體重等。 結(jié)果顯示： (一)經(jīng)驍悉治療12周后，各治療組與對照組相比生理生化指標(biāo)中平均動脈壓、血紅蛋白、肝功能、血糖、血脂、白細(xì)胞、血小板水平無差異，尿滲透壓升高(P<0.01)，24小時尿蛋白減少(P<0.01)，血清尿素氮下降(P<0.05)，組織學(xué)指標(biāo)中腎重/體重(P<0.05)，纖維化指數(shù)(P<0.01)、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤

11、程度(P<0.01)均明顯改善。囊腫指數(shù)小劑量組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而中、大劑量組(P<0.05)，表明驍悉對于多囊腎病大鼠病程及組織學(xué)進(jìn)展均有明顯保護(hù)作用。 (二)免疫組織化學(xué)檢測核增殖抗原(PCNA)可見各治療組平均每個。腎囊腫中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(p<0.01)。 (三)TUNEL 法檢測凋亡可見各治療組平均每個腎囊腫中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(p<0.01)。

12、 (四)免疫組化檢測正常組織、對照組、驍悉治療組P38、P-P38、NF-кB的表達(dá)，正常組織沒有P38、P-P3的表達(dá)，只有少量NF-кB的表達(dá)，主要分別在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)：多囊腎組織三者均高表達(dá)；驍悉治療后三者的表達(dá)均減少。 (五)熒光定量PCR檢測各治療組大鼠腎皮質(zhì)基因P38、PCNA、TGF-β1、MCP-1表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，表明驍悉可抑制囊腫上皮細(xì)胞增殖并抑制炎癥、纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。 (六)We

13、stern Blot檢測可見與對照組相比各治療組P38、P-P38、PCNA、c-myc蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，(p<0.01)。 (七)EMSA檢測NF-кB的活性可見與對照組相比各治療組NF-кB的活化明顯減低(P<0.05)。 (八)安全性方面除治療組脾重/體重較對照組升高外，未見明顯副作用。 從而在組織水平上證實MMF對ADPKD動物模型雄性Han：SPRD雜合子大鼠腎功能的保護(hù)作用是通過抑制。腎皮質(zhì)組織異

14、常增殖凋亡、抗炎抗纖維化、改善ECM重構(gòu)及下調(diào)P<'38>、NF-кB信號通路有關(guān)。 總之，本項研究表明MPA呈劑量依賴性地抑制ADPKD囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，同時抑制了導(dǎo)致腎臟炎癥纖維化細(xì)胞因子的釋放，MMF可有效延緩ADPKD動物模型雄性Han：SPRD雜合子大鼠腎功能進(jìn)展速度，通過抑制腎皮質(zhì)組織異常增殖凋亡、抗炎抗纖維化、改善ECM重構(gòu)，保護(hù)腎功能。但該藥物長期應(yīng)用引起脾臟增大，其副作用值得引起關(guān)注。治療多囊腎病