富含半胱氨酸蛋白61在常染色體顯性多囊腎病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(autosomaldominantpolycystinkidneydisease，ADPKD)是最常見的遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/400-1/1000，我國約有150萬多囊腎病患者。ADPKD病理特征為腎臟形成多個大小不等的液性囊腫，囊腫不斷長大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，60歲以上的患者50％進入終未期腎功能衰竭。多囊腎病除影響腎臟外，還累及全身多個器官。多囊腎病患者子代有50％患病機率。作為遺傳性疾病，比較理想的治

2、療是在基因水平進行干擾或治療，或者退而求其次，爭取延緩病情發(fā)展。為實現(xiàn)這一目標(biāo)，深入探討其發(fā)病機制是必須并且具有現(xiàn)實意義的。 目前研究發(fā)現(xiàn)ADPKD的發(fā)生是由于三個基因(PKD1、PKD2和PKD3)的突變引發(fā)的，其病理改變基本相似。ADPKD囊腫起源于腎小管細(xì)胞，基因突變使腎小管上皮不能正常發(fā)育，細(xì)胞增殖異常增加，同時細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，小管上皮細(xì)胞分泌增加，引起腎小管擴張，形成囊腫并不斷增大。腎小管上皮細(xì)胞功能異常是這一過程中的

3、重要步驟，其中多種細(xì)胞因子參與了這一過程。該文利用基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在多囊腎病患者腎組織中即刻早期基因產(chǎn)物富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich61，Cyr61)顯著增高。 Cyr61具有促進細(xì)胞增殖、ECM重構(gòu)、細(xì)胞粘附、趨化、調(diào)節(jié)新血管生成并參與機體組織的創(chuàng)傷修復(fù)等功能，這些功能是通過受體不同的亞型、不同的信號通路實現(xiàn)的。上述功能涉及了多種多囊腎病發(fā)病后的改變，因此，探索Cyr61在多囊腎病發(fā)病中的作用、機制，有助

4、于明確多囊腎病基因突變?nèi)绾我鹉I小管上皮細(xì)胞功能改變，從而為早期治療尋找有效的干預(yù)措施。 該研究由三部分組成。 一、Cyr61在多囊腎組織及體液中的表達(dá)研究 Cyr61廣泛存在于心、肺、腦、胰腺、胎盤、胎腎，在成人腎組織極低表達(dá)。在實驗中，該文用抗人Cyr61多克隆抗體和自行設(shè)計的Cyr61mRNA原位雜交探針，用高敏感性和特異性的免疫熒光和原位雜交方法研究Cyr61在多囊腎和正常腎組織中的表達(dá)和分布；利用Wes

5、ternBlotting觀察Cyr61蛋白在多囊腎病患者體液中的含量，以及其在人腎小管上皮細(xì)胞和囊腫襯里上皮細(xì)胞中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cyr61在ADPKD組織的囊腫襯里上皮細(xì)胞顯色，PKD1和PKD2基因突變引起的多囊腎病之間顯色一致，正常腎組織近端小管上皮細(xì)胞少量著色，遠(yuǎn)端小管和集合管未見顯色。在正常人和ADPKD患者血清中Cyr61表達(dá)量無差異，正常人尿液未檢出Cyr61，而ADPKD尿液中Cyr61濃度顯著增高，而ADPKD血清

6、中Cyr61水平約為自身尿液的2倍。Cyr61在囊腫襯里上皮細(xì)胞提取液中的含量約為正常人腎小管上皮細(xì)胞的3倍。 二、Cyr61過表達(dá)對人腎小管上皮細(xì)胞的作用 提取多囊腎病患者腎組織總RNA，根據(jù)已知的Cyr61mRNA序列(GenBankZ98053)，自行設(shè)計對引物跨越Cyr61蛋白的全編碼區(qū)。用兩步法RT-PCR選擇擴增編碼Cyr61蛋白的cDNA片段，并將其克隆到融合蛋白表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建的表達(dá)載體p

7、cDNA3.1+Cyr61經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序證實為所需要的質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染入人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)中，經(jīng)過G418篩選、有限稀釋和單克隆化，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+Cyr61的HKC細(xì)胞。經(jīng)RT-PCR、Northern、Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系基因的整合及表達(dá)。對空白HKC、空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的HKC、Cyr61轉(zhuǎn)染的HKC和囊腫襯里上皮細(xì)胞分別進行細(xì)胞外基質(zhì)成分的定量PCR檢測、細(xì)胞增殖率檢

8、測(5-Brdu法)和去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測，Westernblot檢測細(xì)胞增殖與凋亡部分相關(guān)蛋白含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Cyr61轉(zhuǎn)染的HKC中Cyr61與Ⅰ型、Ⅳ型膠原、LNmRNA表達(dá)都明顯增高(p＜0.01)，Ⅳ型膠原增高程度遠(yuǎn)大于Ⅰ型(p＜0.01)，但仍明顯低于囊腫襯里上皮細(xì)胞(p＜0.05)。在10ng/mlEGF的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，Cyr61轉(zhuǎn)染組增殖率顯著增高，與空白囊腫襯里上皮細(xì)胞的增殖率接近，而且其p44/

9、42MAPK顯著高于空白HKC組。無血清培養(yǎng)72h后，Cyr61轉(zhuǎn)染組和囊腫襯里上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于空白HKC組(p＜0.01)，Cyr61轉(zhuǎn)染組磷酸化Akt蛋白含量較空白HKC增高約4倍，磷酸化Bad(Ser136)的含量增高約2倍；在Cyr61抗體存在時，Cyr61轉(zhuǎn)染組和囊腫襯里上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高(p＜0.01)，其細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt和Bad蛋白含量顯著降低，但是兩組之間差異仍顯著(p＜0.05)。 三、Cyr6

10、1RNA干擾對囊腫襯里上皮細(xì)胞的作用 PCR擴增Cyr61基因全長，構(gòu)建pEGFP-N2-Cyr61重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-Cyr61的人腎小管上皮細(xì)胞。自行設(shè)計、合成兩段編碼Cyr61RNA干擾序列的DNA模板，分別與pSilencer2.1連接，轉(zhuǎn)入含pEGFP-n2-Cyr61的HKC中，將熒光抑制效果強的siCyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)入囊腫襯里上皮細(xì)胞中。對空白HKC、siNone轉(zhuǎn)染的囊腫襯里上皮細(xì)胞、

11、siCyr61轉(zhuǎn)染的囊腫襯里上皮細(xì)胞和空白囊腫襯里上皮細(xì)胞分別進行細(xì)胞外基質(zhì)成分的定量PCR檢測、細(xì)胞增殖率檢測(5-Brdu法)和去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測，并Westernblot檢測細(xì)胞增殖與凋亡部分相關(guān)蛋白含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：siCyr61轉(zhuǎn)染的囊腫襯里上皮細(xì)胞中Cyr61與Ⅰ型、Ⅳ型膠原、LNmRNA表達(dá)都明顯降低(p＜0.01)，Ⅰ型降低幅度稍高于Ⅳ型膠原，但無顯著性差異。其細(xì)胞外基質(zhì)成分仍明顯高于空白HKC細(xì)胞(p＜0.05

12、)。在10ng/mlEGF的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，siCyr61轉(zhuǎn)染組的增殖率顯著低于空白囊腫襯里上皮細(xì)胞組，其p44/42MAPK顯著低于空白囊腫襯里上皮細(xì)胞，但仍明顯高于腎小管上皮細(xì)胞；無血清培養(yǎng)72h后，si-Cyr61轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于空白囊腫襯里上皮細(xì)胞(p＜0.01)，但仍顯著低于腎小管上皮細(xì)胞(p＜0.01)，si-Cyr61轉(zhuǎn)染的囊腫襯里上皮細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt蛋白含量較囊腫襯里上皮細(xì)胞下降約60％，磷酸化B

13、ad(Ser136)的含量降低約30％。無血清處理各組凋亡率均顯著低于柔紅霉素誘導(dǎo)組。電鏡觀察顯示柔紅霉素誘導(dǎo)的各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害嚴(yán)重，而si-Cyr61A轉(zhuǎn)染的囊腫襯里上皮細(xì)胞雖出現(xiàn)凋亡小體，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害相對較輕。 以上研究表明，過表達(dá)的Cyr61增加HKC表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)成分，并促進EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，抑制對去血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；利用RNA干擾技術(shù)抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞內(nèi)Cyr61蛋白的表達(dá)，可以顯著抑制囊腫襯里上皮細(xì)胞