Irf1基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用.pdf

1、研究Irfl基因高表達對高糖條件培養(yǎng)下的伴有高血壓大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖的影響，探討Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用及機制，對于糖尿病血管并發(fā)癥的防治具有重要意義。本研究采用體外培養(yǎng)SHR和SD大鼠的VSMC的技術(shù)，建立了Irfl基因的高表達模型。運用PCR等方法克隆Irfl基因的編碼序列，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達載體。通過繪制轉(zhuǎn)染后的VSMC生長曲線、MTT比色法、

2、PCNA免疫細胞化學(xué)檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期的改變，發(fā)現(xiàn)Irfl基因增強了DNA的合成并且加速了VSMC細胞周期的進程，對VSMC的增殖有明顯的促進作用。結(jié)合我室前期工作，初步證明了Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中起重要的作用。 目的：研究Irfl基因高表達對高糖條件培養(yǎng)下的SHR VSMC增殖的影響，探討Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變VSMC增殖中的作用及機制。

3、 材料與方法：①體外采用植塊法培養(yǎng)SHR和SD大鼠的VSMC，并利用免疫熒光細胞化學(xué)的方法鑒定，建立后續(xù)研究的細胞模型。②采用PCR等方法克隆Irfl基因的編碼序列，并在此基礎(chǔ)上將該序列連接到pcDNA3.1質(zhì)粒中，構(gòu)建pcDNA3.1-Irfl的真核表達載體，為后續(xù)高表達細胞模型的建立及其在VSMC增殖中的作用研究奠定基礎(chǔ)。③以SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組為對照，將DcDNA3.1-Irfl轉(zhuǎn)染入SHR和SD大鼠的VSMC中，

4、高糖培養(yǎng)，建立Irfl基因高表達細胞模型。通過繪制轉(zhuǎn)染后的VSMC生長曲線、MTT比色法、PCNA免疫細胞化學(xué)檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期的改變。 結(jié)果：①體外獲得純度較高的SHR和SD大鼠的VSMC，免疫細胞化學(xué)鑒定a-actin陽性，細胞經(jīng)過凍存后可以成功的復(fù)蘇，細胞活力未受明顯影響。②從大鼠肝臟中提取了完整的總RNA，并利用了PCR的方法正確擴增出了Irfl基因的蛋白編碼序列片斷。在此基礎(chǔ)之上，將擴增出的基因連接到

5、了pcDNA3.1真核表達載體中，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達載體。對構(gòu)建成功的真核表達載體進行PCR鑒定，結(jié)果片斷長短與預(yù)期一致。最后對構(gòu)建好的真核表達載體進行測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期序列100％相符，序列插入方向正確，根據(jù)該測序結(jié)果可以判定該質(zhì)粒為成功構(gòu)建的pcDNA3.1-Irfl重組質(zhì)粒。③建立了Irfl基因的高表達模型，轉(zhuǎn)染后VSMC增殖能力呈明顯上升趨勢；PCNA免疫細胞化學(xué)檢測顯示Irfl基因轉(zhuǎn)染后(SH

6、R、SD大鼠)細胞PCNA表達高于SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組(p<0.05)。生長曲線顯示Irfl基因轉(zhuǎn)染后VSMC生長擴增明顯高于SHR轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組。MTT比色法顯示，Irfl轉(zhuǎn)染組(SHR VSMC、SD VSMC)活細胞數(shù)量顯著高于pcDNA3.1-NON組(P<0.01)。在流式細胞儀檢測中我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Irfl的VSMC細胞周期發(fā)生明顯的改變，SHR轉(zhuǎn)染Irfl基因組VSMC居于DNA合成期(S期)的細胞數(shù)量明顯高

7、于SD大鼠轉(zhuǎn)染Irfl基因組和SHR轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NON組(P<0.001)。SHR轉(zhuǎn)染pc：DNA3.1-Irfl組的S期細胞數(shù)量多，表明該基因增強了DNA的合成并且加速了VSMC細胞周期的進程，對細胞的增殖有明顯的作用。 結(jié)論：①SHR和SD大鼠的原代培養(yǎng)成功，可以傳代擴增和凍存復(fù)蘇，并且鑒定為高純度的平滑肌細胞。②成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Irfl的真核表達載體。③Irfl基因在伴有高血壓的糖尿病大鼠大血管病變V