酵母菌胞嘧啶脫氨酶對小鼠T淋巴細(xì)胞殺傷作用的研究.pdf

1、研究目的:以逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV為載體,將釀酒酵母菌來源的胞嘧啶脫氨酶(YCD)基因?qū)胄∈笃⑴K來源T淋巴細(xì)胞,以此為基礎(chǔ)建立體外實(shí)驗(yàn)平臺,分析前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)對YCD+T細(xì)胞的殺傷效率,即5-FC的適宜劑量和最佳作用時間；觀察靶細(xì)胞殺傷過程中產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)；了解感染過程對T細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響；建立單純T淋巴細(xì)胞植入誘導(dǎo)的完全不相合小鼠GVHD模型,綜合評價YCD/5-FC自殺基因系統(tǒng)在移植中的應(yīng)用價值,即其防治G

2、VHD的前景。 第一部分逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-YCD-GFP的構(gòu)建 方法: 1.質(zhì)粒pIRES-YCD擴(kuò)增、鑒定。 2.將YCD基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體pMSCV-IRES-GFP。3連接產(chǎn)物做酶切及測序鑒定。 結(jié)果: 1.瓊脂糖凝膠電泳顯示,質(zhì)粒pIRES-YCD的PCR條帶在500bp左右,提示擴(kuò)增產(chǎn)物為YCD。 2.連接產(chǎn)物經(jīng)Xho I/Not I酶切后電泳釋放-500b

3、p左右條帶,測序結(jié)果"pMSCV-YCD-GFP內(nèi)僅存在一個突變堿基,且為無意突變,不影響氨基酸表達(dá)”,提示病毒載體pMSCV-YCD-GFP構(gòu)建成功。 第二部分 YCD+T淋巴細(xì)胞體外功能研究 方法: 1 逆轉(zhuǎn)錄病毒pMSCV-YCD-GFP轉(zhuǎn)染小鼠T淋巴細(xì)胞。 2.做YCD+T細(xì)胞的蛋白印跡分析。 3.將純化的YCD+T細(xì)胞接種于96孔板,分別加入0～100μmol/L 5-FC,CCK-8法

4、測不同劑量、時間點(diǎn)5-FC對靶細(xì)胞的殺傷情況。 4.以混合培養(yǎng)和transwell法分別觀察YCD+T細(xì)胞凋亡時產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)。 5.將體外培養(yǎng)6天的基因修飾細(xì)胞和單純活化T細(xì)胞做CD4、CD8、CD25、CD44等流式檢測。 結(jié)果: 1.小鼠T淋巴細(xì)胞體外經(jīng)CD3/CD28活化后可高效轉(zhuǎn)染YCD基因,感染效率達(dá)30％～40％,經(jīng)熒光篩選后獲得約90％的高純度GFP+T細(xì)胞。 2.從蛋白水平驗(yàn)證

5、了pMSCV-YCD-GFP可以成功感染小鼠T細(xì)胞,使其分泌YCD蛋白。 3.小鼠T淋巴細(xì)胞表達(dá)的YCD可促使5-FC轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性產(chǎn)物,100μmol/L 5-FC可殺傷超過90％的YCD+T細(xì)胞,作用48小時后即可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡高峰。 4.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與活化T細(xì)胞混合培養(yǎng)時,旁觀者效應(yīng)存在劑量依賴性,即隨著YCD+T細(xì)胞的增多,旁觀者效應(yīng)逐漸增強(qiáng),而transwell中各效靶比均未觀察到旁觀者效應(yīng)。 5.YCD+

6、T細(xì)胞與空轉(zhuǎn)細(xì)胞GFP-T在主要抗原表達(dá)上無明顯差異：均未出現(xiàn)CD25表達(dá)異常增高,CD44表達(dá)都有所增高；CD4/CD8比例較單純活化T細(xì)胞降低。 第三部分動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒎椒?1.移植細(xì)胞的準(zhǔn)備：制備C57BL/6小鼠BMCs,調(diào)濃度為2.5×107/ml;Stemcell磁珠負(fù)選法收集C57BL/6小鼠脾臟內(nèi)CD3+T細(xì)胞。 2.將BALB/c小鼠分為A～E五組,全部給予60Co-γ射線致死性TBI(5G

7、y,100cGy/min),同日尾靜脈注射5×106 BMCs,按不同分組分別給予0.2ml PBS、1×106、3×106、5×106及7×106個CD3+T細(xì)胞。 3.移植后觀察小鼠體重、毛發(fā)、皮膚及生存狀況。 4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1D、E兩組小鼠移植后期出現(xiàn)體重減輕、少動、翹毛、腹瀉等GVHD表現(xiàn),A、B、C三組未出現(xiàn)。2 E組小鼠肝臟、脾臟出現(xiàn)典型病理學(xué)GVHD表現(xiàn)。 結(jié)論:構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

8、pMSC-YCD-GFP能夠轉(zhuǎn)染活化的小鼠T淋巴細(xì)胞,并使其表達(dá)YCD蛋白,后者可以高效催化5-FC轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性產(chǎn)物并殺傷T細(xì)胞,殺傷過程產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)較弱,不會大范圍殃及“無辜”。YCD基因的插入并未影響轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的免疫功能,本實(shí)驗(yàn)方法保留了相當(dāng)數(shù)量的原始細(xì)胞,后者較記憶細(xì)胞更易誘發(fā)GVHD;淋巴細(xì)胞歸巢受體CD44表達(dá)增高說明細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷徙至所需組織或器官并發(fā)揮作用的能力；轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞較單純活化細(xì)胞CD4/CD8比例降低,