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1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文非小細(xì)胞肺癌反殺傷T淋巴細(xì)胞的實驗研究姓名:王海東申請學(xué)位級別:博士專業(yè):外科學(xué)(胸心外)指導(dǎo)教師:蔣耀光20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文以及凋亡的改變,探討腫瘤自身表達(dá)的Fas/FasL對其自身活性的影響,即腫瘤是否可通過自身表達(dá)的Fas/FasL引起自殺。另外由于T細(xì)胞可以通過自分泌方式凋亡,即T細(xì)胞自身表達(dá)的Fas/FasL可以引起T細(xì)胞自身凋亡,因此用抗FasL抗體(NOK一1)封閉細(xì)胞本身的Fa
2、sL表達(dá),利用MTT和流式細(xì)胞儀方法,檢測封閉FasL表達(dá)與否細(xì)胞活力及凋亡的改變。第三部分首先采用膠原酶原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),傳代培養(yǎng)后用免疫組織化學(xué)的方法,用VIII因子相關(guān)抗原鑒定,同時用免疫組織化學(xué)方法檢測HUVEC細(xì)胞Fas表達(dá)的情況;另外利用Jurkat細(xì)胞來作為活化的T淋巴細(xì)胞,將A549轉(zhuǎn)染pSiFasL、A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi兩組細(xì)胞分別與HUVEC和Jurkat細(xì)胞混合培養(yǎng),
3、同時分別用流式細(xì)胞儀檢測不同效靶比、NOK一1封閉FasL表達(dá)與否,HUVEC和Jurkat細(xì)胞凋亡的情況。實驗的主要結(jié)果如下:1各組siRNA質(zhì)粒干擾效率存在差異。WesternBlot結(jié)果證實在Fas—siRNA的設(shè)計中pSi—Fasl的DNA序列遵循了其中Angela六條原則,而其它兩個DNA序列則遵循了Angela五條原則,pSi—Fasl干擾效果最好;FasL—siRNA的設(shè)計中pSi—FasL2的DNA序列遵循了其中Ange
4、la六條原則,而其它兩個DNA序列則遵循了Angela五條原則,pSi—FasL2干擾效果最好。將pSi—Fasl、pSi—FasL2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后即得到Fas/FasL被特異性基因靜默的肺腺癌細(xì)胞株。2親代A549細(xì)胞在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase一3、Caspase8,高表達(dá)FasL;A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSi—Fas后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase一3、Caspase8,高表達(dá)FasL;A549細(xì)胞
5、轉(zhuǎn)染pSi—FasL后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、FasL、Caspase一3、Caspase一8;A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase3、Caspase一8,高表達(dá)FasL。MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示三組細(xì)胞在細(xì)胞活力和凋亡方面沒有變化。3MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示親代A549細(xì)胞和A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi在是否NOK1封閉FasL表達(dá),其細(xì)胞活力及凋亡均無改
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