非小細(xì)胞肺癌反殺傷T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文非小細(xì)胞肺癌反殺傷T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王海東申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：外科學(xué)（胸心外）指導(dǎo)教師：蔣耀光20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文以及凋亡的改變，探討腫瘤自身表達(dá)的Fas／FasL對(duì)其自身活性的影響，即腫瘤是否可通過(guò)自身表達(dá)的Fas／FasL引起自殺。另外由于T細(xì)胞可以通過(guò)自分泌方式凋亡，即T細(xì)胞自身表達(dá)的Fas／FasL可以引起T細(xì)胞自身凋亡，因此用抗FasL抗體(NOK一1)封閉細(xì)胞本身的Fa

2、sL表達(dá)，利用MTT和流式細(xì)胞儀方法，檢測(cè)封閉FasL表達(dá)與否細(xì)胞活力及凋亡的改變。第三部分首先采用膠原酶原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，傳代培養(yǎng)后用免疫組織化學(xué)的方法，用VIII因子相關(guān)抗原鑒定，同時(shí)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞Fas表達(dá)的情況；另外利用Jurkat細(xì)胞來(lái)作為活化的T淋巴細(xì)胞，將A549轉(zhuǎn)染pSiFasL、A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi兩組細(xì)胞分別與HUVEC和Jurkat細(xì)胞混合培養(yǎng)，

3、同時(shí)分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同效靶比、NOK一1封閉FasL表達(dá)與否，HUVEC和Jurkat細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下：1各組siRNA質(zhì)粒干擾效率存在差異。WesternBlot結(jié)果證實(shí)在Fas—siRNA的設(shè)計(jì)中pSi—Fasl的DNA序列遵循了其中Angela六條原則，而其它兩個(gè)DNA序列則遵循了Angela五條原則，pSi—Fasl干擾效果最好；FasL—siRNA的設(shè)計(jì)中pSi—FasL2的DNA序列遵循了其中Ange

4、la六條原則，而其它兩個(gè)DNA序列則遵循了Angela五條原則，pSi—FasL2干擾效果最好。將pSi—Fasl、pSi—FasL2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后即得到Fas／FasL被特異性基因靜默的肺腺癌細(xì)胞株。2親代A549細(xì)胞在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase一3、Caspase8，高表達(dá)FasL；A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSi—Fas后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase一3、Caspase8，高表達(dá)FasL；A549細(xì)胞

5、轉(zhuǎn)染pSi—FasL后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、FasL、Caspase一3、Caspase一8；A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi后在基因和蛋白水平均低表達(dá)Fas、Caspase3、Caspase一8，高表達(dá)FasL。MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示三組細(xì)胞在細(xì)胞活力和凋亡方面沒(méi)有變化。3MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示親代A549細(xì)胞和A549轉(zhuǎn)染psiNEGativeRNAi在是否NOK1封閉FasL表達(dá)，其細(xì)胞活力及凋亡均無(wú)改