苯對小鼠淋巴細胞端粒酶活性的影響及硒的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、苯系化合物為一類芳香族化合物，多為無色至淺黃色透明、易揮發(fā)的油狀液體,具有強烈芳香氣味，主要包括苯（Benzene）、甲苯（Toluene）、二甲苯（Xylene）等。苯系化合物多引起骨髓抑制及免疫系統(tǒng)抑制，主要產(chǎn)生血液毒性，可導致細胞及基因毒性。它可產(chǎn)生多種生物學效應，引起造血細胞凋亡增多、肝細胞及祖細胞復制增殖。抑制細胞因子分泌，影響T淋巴細胞的功能及外周血中亞群的改變。引起外周血血象改變，淋巴細胞及紅細胞減少，引起微核。導致細胞凋

2、亡、突變、細胞復制，引起DNA斷裂，致淋巴細胞結構及其它方面染色體畸變，染色體損傷，非整倍體改變、染色體缺失、染色體易位等。苯進入人體，首先輸入肝，在相關酶的作用下，活化代謝，其代謝產(chǎn)物及中間產(chǎn)物隨即分布至血液、腎臟、脾臟、胸腺、骨髓等造血器官，作用于淋巴細胞和骨髓細胞，經(jīng)過對染色體損害，代謝產(chǎn)物可引起血液疾病及癌樣變。它可引起再障貧血，引起急性髓性白血病、血管瘤、骨髓異常增生綜合癥、腺淋巴瘤、慢性淋巴瘤、慢性白血病等造血器官腫瘤，苯亦

3、可導致多器官腫瘤。苯及其代謝物選擇性作用于某些非致死性染色體，端粒是苯的敏感作用位點及檢測的選擇點。針對苯的遺傳毒性、染色體損傷、及腫瘤建模的研究已經(jīng)多見。苯中毒的研究已從染色體改變深入到基因水平研究。 端粒酶是逆轉錄酶，由RNA和蛋白質組成的核糖蛋白酶，它主要有三個組成成分：端粒酶RNA組分（telomerase RNA component，TERC）、端粒酶相關蛋白（telomerase-associated protein

4、，TELPI）和端粒酶逆轉錄酶催化蛋白亞單位（telomerase reverse transcriptase，TERT）。端粒酶能合成新的端粒DNA，添加到染色體末端，來補償端粒的丟失、粘連、重組阻止端粒的縮短，使細胞逃脫程序性死亡。在大多數(shù)體細胞和正常組織中，端粒酶活性不表達或低水平表達，生殖細胞、胚胎細胞、造血干細胞、骨髓細胞、腫瘤、癌組織中高表達。它使端粒，染色體末端重復DNA系列呈帽子結構維持染色體穩(wěn)定性，與細胞衰老、分化、腫

5、瘤形成有關，維持長度并跨過生物鐘，進行分裂，細胞衰老、凋亡、永生化過程中激活端粒酶高表達，引起腫瘤和癌癥，并且表達水平同腫瘤惡化程度正相關。端粒酶激活是腫瘤形成的必經(jīng)途徑，它是腫瘤具特異性和普遍性的效應標志物和早期分子生物學標志物。 硒具有營養(yǎng)作用，在體內(nèi)發(fā)揮消除自由基、抗氧化等作用。營養(yǎng)劑量硒具有激活端粒酶活性、延長端粒、延長細胞壽命的功能。它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起預防作用，它可以抗衰老、抑制腫瘤、癌癥。 苯對細胞產(chǎn)

6、生毒性，本研究采用動物實驗構建模型對其進行毒性評價。選用健康昆明小鼠，隨機分成幾組，分別設不同劑量組用苯對其進行染毒，并設不同劑量苯聯(lián)合硒組進行處理，同時設陰性對照和試劑對照。染毒后觀察變化，收獲外周血淋巴細胞，采用端粒重復擴增分析法（telomere repeat amplification protocol assay，TRAP）法檢測其端粒酶活性。分析苯及硒對淋巴細胞端粒酶活性的影響，觀察兩者的相關性。鑒于此，我們研究了苯對小鼠淋

7、巴細胞端粒酶活性的毒性影響及硒的調(diào)節(jié)作用，進一步了解苯致腫瘤及癌癥的機制，旨在從端粒系統(tǒng)獲得新的苯暴露早期效應生物學標志物和易感性標志物。 第一部分、苯對小鼠淋巴細胞端粒酶活性的影響及硒的調(diào)節(jié)作用。 目的：本部分通過研究苯對小鼠淋巴細胞端粒酶活性的影響及硒的調(diào)節(jié)作用，評價端粒酶作為生物標志物對苯致癌癥的分子機制的影響，旨在獲得新的苯暴露早期效應生物學標志物和易感性標志物。 方法：選擇6～8周齡的健康雄性昆明小鼠，

8、25-30g左右，40只隨機分成8組，每組5只。分別設100.0 mg/kg 苯、200.0 mg/kg 苯及400.0 mg/kg 苯染毒組，200.0 mg/kg 苯+0.75 mg/kg 亞硒酸鈉、200.0 mg/kg 苯+1.5 mg/kg 亞硒酸鈉及200.0 mg/kg 苯+3.0 mg/kg 亞硒酸鈉處理組，陰性對照組及試劑對照組。對小鼠采用腹腔注射染毒，連續(xù)5天，末次染毒48h后，眼球摘除取外周血，分離淋巴細胞。用TR

9、AP-ELISA法定量分析淋巴細胞端粒酶活性，在前引物P1-TS的作用下，端粒酶先以自身為模板合成端粒DNA，然后在前引物P1-TS和后引物P2作用下對TTAGGG結構進行PCR特異性擴增。取5μl PCR產(chǎn)物進行變性，再與地高辛標記的探針進行雜交，加入到生物素標記的微孔板中，最后加入TMB底物，在450nm和690nm波長處讀取溶液的OD值，A450-A690的值即我們的端粒酶活性值。比較不同組間的端粒酶活性差異，分析苯對端粒酶的毒性

10、作用和硒的調(diào)節(jié)作用，利用統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。 結果：陰性對照和試劑對照呈現(xiàn)微弱的端粒酶活性表達，活性值均在正常范圍內(nèi)。各劑量苯處理組與陰性對照和試劑對照相比，端粒酶活性陽性，均值范圍均升高，其中100.0 mg/kg 苯組有統(tǒng)計學差異（P<0.01），說明苯刺激了端粒酶的表達。與陰性對照和試劑對照相比，各劑量苯聯(lián)合硒作用組端粒酶活性均增高，其中200.0 mg/kg 苯+0.75 mg/kg 亞硒酸鈉組有顯著性差異（P<0.0

11、01），三組活性值均為陽性。同時，與相應的200.0 mg/kg 苯組相比，端粒酶活性均增加，說明硒激活了端粒酶活性。 結論：本實驗中，活體不同濃度苯作用均增高端粒酶活性表明小鼠淋巴細胞得到激活和增殖，端粒酶可能是苯刺激淋巴細胞的一種敏感的早期效應標志物。硒可以上調(diào)小鼠淋巴細胞端粒酶活性。說明端粒酶是潛在的苯暴露致腫瘤的早期效應生物標志物。 第二部分、熒光定量RT-PCR快速檢測重要腸道病毒的研究。 目的：利用熒

12、光定量RT-PCR技術建立一種快速檢測重要腸道病毒的方法。 方法：從GeneBank下載相應腸道病毒的基因系列，利用TaqMan技術，根據(jù)腸道病毒基因的相對保守序列參考國外文獻分別設計一對共引物及相應的TaqMan探針。首先檢測熒光定量RT-PCR的特異性，以PolioⅠ、Ⅱ、Ⅲ、EV71、CA16和CA24標準株作為陽性標準，輪狀病毒、諾沃克病毒為陰性標準，并設陰性對照。對反應體系及反應條件進行優(yōu)化。其次建立熒光定量RT-PC

13、R的標準曲線，以EV71為標準株，用通用引物構建質粒標準品，測定OD值定量后，十倍倍比稀釋標準品（108-104拷貝/μl）并用建立的方法構建定量標準曲線。同時，以EV71為標準株進行病毒效價滴定后作為參考株，根據(jù)TCID50十倍倍比稀釋至8個濃度，并設置陰性對照用建立的方法構建靈敏度標準曲線。最后，收集2006年深圳市疑似腸道病毒感染的病人糞便標本共69份，用通用引物進行傳統(tǒng)的RT-PCR檢驗，再用熒光定量RT-PCR進行檢驗，驗證其

14、應用價值。 結果：所有對照經(jīng)本研究建立的體系檢驗，該方法具有高度的特異性，PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16和CA24陽性標準均觀察到熒光信號增強，輪狀病毒、諾沃克病毒和陰性對照均未觀察到熒光信號增強，說明無假陽性結果。陽性標準和陰性標準間無交叉反應。用EV71標準株構建的質粒標準品，建立的定量標準曲線最低檢測限為105拷貝/μl，曲線斜率為-3.474，在Y軸截距為53.67，R2=0.999，PCR

15、擴增效率為94％。用EV71標準株進行病毒效價滴定后的TCID50，建立了靈敏度標準曲線，本體系檢測到的最低濃度值為5.0 TCID50，曲線斜率為-3.230，在Y軸截距為16.36，R2=0.991，PCR擴增效率為104.0％。說明本研究建立的標準曲線各個濃度的相關系數(shù)非常好，PCR反應對模板的擴增很完全。臨床標本驗證中，89份腸道病毒疑似病例的糞便標本用建立的熒光RT-PCR和傳統(tǒng)的RT-PCR進行檢測，普通RT-PCR檢出56

16、份手足口病陽性，檢出率為62.92％，本研究建立的熒光RT-PCR檢出72份陽性結果，檢出率為80.9％，熒光RT-PCR檢出率顯著高于普通RT-PCR，兩者符合率為79.78％。說明熒光RT-PCR可以用于日常疑似腸道病毒感染的臨床標本的篩檢工作。 結論：成功建立了快速檢測重要腸道病毒共引物的熒光定量RT-PCR方法，該方法具有敏感性高、特異性好、效率高、穩(wěn)定性好、準確、簡單等優(yōu)點，篩檢標本檢出率及符合性好，可以作為腸道病毒的