腐胺對(duì)CAOV3細(xì)胞和胃癌組織端粒酶活性的影響.pdf

1、多胺(polyamine)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的天然脂肪族多價(jià)正離子,包括腐胺(putrescine)、精脒(spermidine)和精胺(spermine),與細(xì)胞的增殖、分化、再生以及腫瘤的惡化密切相關(guān).多胺不僅能促進(jìn)正常細(xì)胞的生長(zhǎng),而且對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用.多胺生物合成限速酶鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)的不可逆抑制劑二氟甲基鳥氨酸(2-difluromethyl or

2、nithine,DFMO)通過臨床觀察,是一種療效較好的抗癌藥物,尿、血清中的多胺含量作為腫瘤標(biāo)記物也已在臨床應(yīng)用.端粒是真核生物線性染色體一種特殊結(jié)構(gòu),由一簡(jiǎn)單重復(fù)G的DNA序列及蛋白組成,人和各種脊椎動(dòng)物端粒DNA序列均為(TTAGGG)n,端粒隨細(xì)胞分裂而不斷縮短至一定程度時(shí),細(xì)胞將停止分裂,進(jìn)入老化期,甚至死亡.因此,端粒在細(xì)胞衰老和腫瘤增殖中有重要作用.材料與方法:1.材料:CAOV3細(xì)胞系來源于中國(guó)醫(yī)大細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;腫瘤

3、標(biāo)本來源于中國(guó)醫(yī)大附屬二院.PCR Kit;PBR322/HaeⅢ DNA marker;二甲基亞砜(DMSO);腐胺;RPMI-1640培養(yǎng)基;小牛血清;引物:TS AATCCGTCGAG-CAGAGTT,CX CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA.2.方法.2.1.常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng):在37℃,5﹪CO<,2>飽和濕度條件下,用含10﹪小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)CAOV3細(xì)胞系.2.2.測(cè)生長(zhǎng)曲線:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞

4、的10<'3>個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,24h細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的腐胺繼續(xù)培養(yǎng),MTT法連續(xù)5天測(cè)其生長(zhǎng)曲線.2.3CAOV3細(xì)胞端粒酶模板制備:將收集的細(xì)胞用PBS洗滌2次,300g離心10min,加入裂解緩沖液,16000g離心30min,取上清-70℃凍存?zhèn)溆?2.4腫瘤組織端粒酶模板制備:取腫瘤組織100mg用冷的磷酸緩沖液沖洗血液,制成勻漿,加入裂解緩沖液,離心取上清.取5μl測(cè)定蛋白含量,其余-70℃凍存?zhèn)溆?2.5TR

5、AP-銀染法檢測(cè)端粒酶活性.PCR擴(kuò)增:條件是94℃30秒,50℃30秒,72℃1分30秒,30個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)10min.酚、氯仿油提,乙醇沉淀.12﹪非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳.硝酸銀染色:10﹪冰醋酸中固定,ddH<,2>O清洗,0.2﹪AgNO<,3>染色,ddH<,2>O清洗,0.02﹪甲醛、0.28mmol/LNa<,2>CO<,3>溶液中顯色,至出現(xiàn)清晰條帶,用回收的10﹪冰醋酸固定液終止反應(yīng).2.6凝膠分析系統(tǒng)分析實(shí)