Decoy核酸在LNCaP細(xì)胞中作用機(jī)制研究.pdf

1、Ⅱq大學(xué)m士學(xué)位論文Decoy核酸在LNCaP細(xì)胞中作用機(jī)制研究DecoynuclearacidtreatedinLNCaPcellsandpAktdownstream院系專業(yè)碩士研究生導(dǎo)師導(dǎo)師組成員導(dǎo)師組成員腫瘤醫(yī)院腫瘤學(xué)楊立峰葉定偉教授姚旭東副教授張世林副教授D“州棱礁在LNCaP細(xì)胞巾作用機(jī)制研究中史摘gDecoy核酸在LNCaP細(xì)胞中作用機(jī)制研究中文摘要目的前列腺癌在接受內(nèi)分泌治療2年左右，約50％的忠者出現(xiàn)激素抵抗，進(jìn)展為去勢

2、治療失敗前列腺癌(CRPC)。即使在CRPC狀態(tài)下，雄激素受體(AR)作為轉(zhuǎn)錄因子仍然持續(xù)激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生PSA。通過雄激素受體反應(yīng)元件陷阱核酸(AREdecoyDNA)在LNCaP細(xì)胞中作用，阻斷AR激活，研究其對下游信號通路的影響。方法根據(jù)根據(jù)tl前已知的位于PSA基因啟動(dòng)子170附近的AREI序列(AGAACAgcaAGTGCT)和位于PSA基因啟動(dòng)子一394附近的AREII序列(GGATcAgggAGTcTc)，人工合成

3、decoy核酸，并進(jìn)行部分硫代和完全硫代修飾，同時(shí)敢側(cè)術(shù)端標(biāo)記生物素或FITC。對照組核酸兩端分別標(biāo)記生物素或FITC。應(yīng)用凝膠電泳阻抑分析方法(EMSA)檢測4種人工合成的deeov核酸與LNCaP細(xì)胞核蛋白提取物特異性結(jié)合能力，模擬其與雄激素受體(ARl特異性結(jié)合情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取與核蛋白特異性結(jié)合晟強(qiáng)的decoy核酸，通過脂質(zhì)體Lipofectin””進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后通過MTS法檢測各組LNCaP細(xì)胞增殖能力；使用共聚焦顯

4、微鏡觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：通過提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)DNA行水平電泳檢查有無凋亡改變；通過westemblot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)隋況及信號通路改變。結(jié)果l凝膠電泳阻抑分析方法(EMSA)：毗lnM，10nM，IOOnM分別作為探針濃度，通過EMSA檢測四種修飾過的decoy核酸，完全硫代的ARE1、ARE—IIdecoy核酸相對于部分硫代修飾的AREI、ARE—IIdecoy核酸以及對照核酸，與LNCaP細(xì)胞核蛋白特異性結(jié)臺能力