IAP家族蛋白Livin在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡(也叫程序性細(xì)胞死亡)，是一種由基因控制的主動(dòng)性的細(xì)胞死亡過(guò)程，它對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是至關(guān)重要的。Livin(又稱ML-IAP和KIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的一個(gè)成員，它含有一個(gè)IAP家族特征性的桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculoviralIAPrepeat，BIR)結(jié)構(gòu)域和羧基端的環(huán)狀鋅指樣結(jié)構(gòu)區(qū)域(RINGzinc-fingerdomain)。已有報(bào)

2、道指出，Livin可以通過(guò)其BIR結(jié)構(gòu)域在體外直接與caspase-3和-7結(jié)合、在體內(nèi)與caspase-9結(jié)合及與促凋亡因子Smac/DIABLO相互作用。且Livin是個(gè)相對(duì)弱的caspases抑制子，關(guān)于這個(gè)分子的更為詳細(xì)的抗凋亡的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究和闡明，為此，我們進(jìn)行了下面的研究并得出了一些結(jié)論。 在本研究中，我們首次證實(shí)了Livin可以充當(dāng)E3泛素連接酶并可以泛素化降解Smac/DIABLO。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)證明

3、，Livin的BIR結(jié)構(gòu)域和RING區(qū)域?qū)τ贚ivin泛素化降解Smac/DIABLO是必不可缺少的。 我們也發(fā)現(xiàn)，Livin是個(gè)不穩(wěn)定的蛋白，其半衰期為4小時(shí)。泛素蛋白酶抑制劑MG132或ALLN可以阻斷Livin的降解，說(shuō)明Livin的降解是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)并發(fā)生的。 同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，RING結(jié)構(gòu)域在Livin的自身泛素化過(guò)程中起了決定性的作用，而B(niǎo)IR結(jié)構(gòu)域則表現(xiàn)出對(duì)其自身降解具有某種抑制作用。

4、 我們構(gòu)建了幾個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變Cys124，Trp134，His144和RING區(qū)域的缺失突變，BIR結(jié)構(gòu)域的突變大大增加了Livin的不穩(wěn)定性，而且突變后的Livin也不再能和Smac/DIABLO結(jié)合，從而導(dǎo)致其抗凋亡功能的減弱，而RING區(qū)域的缺失突變?nèi)匀豢梢院蚐mac/DIABLO結(jié)合。除泛素化降解機(jī)制外的其他的尚不可知的非泛素-蛋白酶體途徑依賴的機(jī)制可能參與了BIR結(jié)構(gòu)域突變體的降解，從而使BIR點(diǎn)突變體表現(xiàn)出比野生

5、型Livin更加不穩(wěn)定。 我們的研究賦予Livin一個(gè)新的重要的功能：Livin可以通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑來(lái)發(fā)揮E3泛素連接酶的功能促進(jìn)促凋亡因子Smac/DIABLO的泛素化降解，從而在鬼臼乙叉甙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中更好的發(fā)揮其抑凋亡的功能。這為L(zhǎng)ivin發(fā)揮在細(xì)胞凋亡中的抑制作用尋找到了一條新的通路。 蛋白最先發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的研究中，ARTS是特殊的隔蛋白，在活細(xì)胞中定位于線粒體中。ARTS最先出現(xiàn)在

6、TGF-β介導(dǎo)的凋亡通路中，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)ARTS在多種促凋亡的刺激因子如阿拉伯糖、鬼臼乙叉甙、星形孢菌素和Fas誘導(dǎo)的凋亡通路中起作用，并借助其P-loop結(jié)構(gòu)域來(lái)介導(dǎo)凋亡。在凋亡刺激下，ARTS從線粒體中釋放出來(lái)，并通過(guò)和IAP家族成員XIAP結(jié)合并拮抗之而起到促凋亡的作用。ARTS和XIAP結(jié)合后使XIAP的蛋白質(zhì)水平大大降低并激活半胱氨酸蛋白酶從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。然而，ARTS是否能結(jié)合IAP家族的另一個(gè)成員Livin至今尚未有報(bào)道。而

7、且，在非凋亡的細(xì)胞中，ARTS通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑保持在低的蛋白水平；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，ARTS穩(wěn)定、不再發(fā)生泛素化降解從而發(fā)揮其促凋亡的功能。但對(duì)于ARTS如何在這一系統(tǒng)中被調(diào)節(jié)尚未有系統(tǒng)的研究。 在本研究中，我們第一次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ARTS可以和IAP家族的另一個(gè)成員Livin在凋亡的293T細(xì)胞和COS7細(xì)胞中結(jié)合，且這種結(jié)合是不依賴于ARTS羧基端的68個(gè)氨基酸、G3-loop區(qū)和其P-loop區(qū)

8、結(jié)構(gòu)域，Livin的BIR和RING結(jié)構(gòu)域?qū)τ谒鼈兊慕Y(jié)合也是不必要的。 ARTS和Livin在非凋亡細(xì)胞中結(jié)合并定位在胞質(zhì)中而在細(xì)胞凋亡的情況下結(jié)合且共定位在核中。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Livin不能充當(dāng)E3連接酶去泛素化降解ARTS，同時(shí)也驗(yàn)證了凋亡細(xì)胞中ARTS不能發(fā)生泛素化降解。 我們也發(fā)現(xiàn)在凋亡細(xì)胞中、ARTS存在的情況下，Livin可以快且顯著的發(fā)生降解。Livin的這種降解通過(guò)泛素蛋白酶體的抑制劑