表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)及EGFR單克隆抗體聯(lián)合治療非小細(xì)胞肺癌的研究.pdf

1、目的:
　　 肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80％，雖然手術(shù)、化放療等治療手段在肺癌的治療中廣泛應(yīng)用，但其療效仍然令人失望。近年來(lái)出現(xiàn)的以EGFR為靶點(diǎn)的靶向治療使部分患者生存率明顯提高，尤其對(duì)于EGFR外顯子19、21突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者EGFR-TKI明顯有效，但目前對(duì)于EGFR突變陰性和EGFRT790M突變的繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌患者沒(méi)有有效的治療方法。本研究通過(guò)EGFR-TKI和E

2、GFR單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用探討治療EGFR突變陰性和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥的NSCLC的療效。
　　 方法:
　　 體外實(shí)驗(yàn)：以EGFR-TKI和EGFR單克隆抗體單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)EGFR突變陰性（A549，LTEP）和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥（H1975）的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，同時(shí)應(yīng)用流氏細(xì)胞儀Annexin V-FITC法檢測(cè)EGFR-TKI和EGFR單克隆抗體單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)

3、EGFR突變陰性（A549，LTEP）和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥（H1975）的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的凋亡率，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：對(duì)于接種了EGFR突變陰性（A549，LTEP）和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥（H1975）的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的裸鼠移植瘤給予EGFR-TKI和EGFR單克隆抗體單獨(dú)和聯(lián)合治療。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）的裸鼠移植瘤中Ki-67、PCNA的表達(dá)情況，

4、了解聯(lián)合靶向治療對(duì)EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）的裸鼠移植瘤的增殖抑制性。同時(shí)應(yīng)用Western blot檢測(cè)EGFR突變陰性（A549，LTEP）和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥（H1975）的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的裸鼠移植瘤中 EGFR下游信號(hào)蛋白 STAT3，P-STAT3，AKT，p-AKT，MAPK，p-MAPK等的表達(dá)水平。最后應(yīng)用EGFR突變陰性和EGFRT790M突變繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)

5、胞肺癌原代培養(yǎng)及藥敏技術(shù)驗(yàn)證EGFR-TKI和EGFR單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用的療效。
　　 結(jié)果:
　　 1.應(yīng)用MTT法檢測(cè)西妥昔單抗聯(lián)合特羅凱對(duì)EGFR突變陰性的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)-549、LTEP及L858R和T790M突變陽(yáng)性的NSCLC細(xì)胞系H1975的增殖活性的影響，分別應(yīng)用濃度為1.100μg/ml和0.1-10μM的西妥昔單抗和特羅凱抑制A-549，LTEP，H1975細(xì)胞系的生長(zhǎng)，可以看出隨著濃度的增加，這

6、三種細(xì)胞系受到了抑制，對(duì)EGFR突變陰性的NSCLC細(xì)胞系聯(lián)合應(yīng)用特羅凱和西妥昔單抗并沒(méi)有顯示出比單一應(yīng)用這兩種藥更強(qiáng)的抑制性，對(duì)L858R和T790M突變陽(yáng)性的NSCLC細(xì)胞系H1975聯(lián)合應(yīng)用特羅凱和西妥昔單抗顯示出比單一應(yīng)用這兩種藥更強(qiáng)的抑制性。
　　 2.應(yīng)用Annexin V-FITC法檢測(cè)西妥昔單抗聯(lián)合特羅凱對(duì)EGFR突變陰性的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)-549、LTEP及L858R和T790M突變陽(yáng)性的NSCLC細(xì)胞系H1

7、975的凋亡率的影響，分別應(yīng)用濃度為1，10μg/ml和0.5，5μM的西妥昔單抗和特羅凱抑制A-549、LTEP、H1975細(xì)胞系的生長(zhǎng)，可以看出對(duì)EGFR突變陰性的NSCLC細(xì)胞系聯(lián)合應(yīng)用特羅凱和西妥昔單抗并沒(méi)有顯示出比單一應(yīng)用這兩種藥更強(qiáng)的凋亡率，而對(duì)L858R和T790M突變陽(yáng)性的NSCLC細(xì)胞系H1975聯(lián)合應(yīng)用特羅凱和西妥昔單抗顯示出比單一應(yīng)用這兩種藥更強(qiáng)的凋亡率。
　　 3.通過(guò)抑瘤效應(yīng)觀察顯示：對(duì)于EGFR突變陰

8、性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549、LTEP）移植瘤，對(duì)照組、特羅凱組或西妥昔單藥組及聯(lián)合應(yīng)用組間的移植瘤進(jìn)行性增大明顯，瘤體較重，但各組間瘤重?zé)o顯著性差異（P>0.05）；即聯(lián)合用藥不能使EGFR突變陰性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549、LTEP）移植瘤變小。而對(duì)于L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤，對(duì)照組、特羅凱組間的移植瘤進(jìn)行性增大明顯，瘤體較重，而西妥昔單藥組的移植瘤增長(zhǎng)緩慢，聯(lián)合用藥組移植瘤完全

9、消失，聯(lián)合用藥組比單藥組及對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）；即聯(lián)合用藥使L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤消失。
　　 4.提取EGFR突變陰性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549、LTEP）及L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤的組織蛋白，采用Westernblotting檢測(cè)其中EGFR信號(hào)通路相關(guān)蛋白STAT3、AKT、MAPK等的表達(dá)水平及p-STAT3/

10、STAT3、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK等的蛋白磷酸化程度。在EGFR突變陰性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549、LTEP）移植瘤中與對(duì)照組相比，單藥組和聯(lián)合組中上述所有EGFR下游信號(hào)蛋白的表達(dá)水平及磷酸化程度均分別沒(méi)有大的差異，而在L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤中，與對(duì)照組相比，特羅凱組中上述所有EGFR下游信號(hào)蛋白的磷酸化程度均分別沒(méi)有大的差異；而在西妥昔單抗治療組和聯(lián)合治療組中的

11、組織中，p-STAT3/STAT3、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK蛋白磷酸化程度較其它組低。顯示在L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤中，西妥昔單抗單藥或西妥昔單抗聯(lián)合特羅凱治療可以部分抑制了EGFR下游信號(hào)的活化。
　　 5.在L858R和T790M突變陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（H1975）移植瘤中免疫組化顯示：與對(duì)照組相比，特羅凱組中Ki-67、PCNA表達(dá)水平無(wú)明顯差別，而在西

12、妥昔單抗組和聯(lián)合用藥組中，Ki-67、PCNA的表達(dá)明顯降低，提示細(xì)胞增殖下降。
　　 6.我們檢測(cè)特羅凱和西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于15例EGFR突變陰性和8例T790M突變陽(yáng)性的繼發(fā)性耐藥的NSCLC患者原代細(xì)胞的影響，應(yīng)用濃度分別為50μg/ml和1μM的西妥昔單抗和特羅凱作用于EGFR突變陰性的NSCLC患者原代細(xì)胞，結(jié)果顯示這三組間T/C值沒(méi)有顯著性差異（P>0.05），對(duì)于T790M突變陽(yáng)性的繼發(fā)性耐藥的NSCLC原代細(xì)

13、胞這三組間T/C值有顯著性差異（P<0.05），聯(lián)合用藥組療效明顯好于單藥組。進(jìn)一步驗(yàn)證了特羅凱和西妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于EGFR突變陰性的NSCLC患者無(wú)效，但對(duì)于T790M突變陽(yáng)性的繼發(fā)性耐藥的NSCLC患者有效。
　　 結(jié)論:
　　 對(duì)于T790M突變陽(yáng)性的繼發(fā)性耐藥的非小細(xì)胞肺癌，西妥昔單抗和特羅凱聯(lián)合應(yīng)用可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，使裸鼠體內(nèi)移植瘤縮小，同時(shí)抑制了EGFR下游信號(hào)蛋白p-STAT3/STAT