肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子降低EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)上皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑-吉非替尼的敏感性.pdf

1、目的:
　　非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占據(jù)肺癌的85％。在非小細(xì)胞肺癌病人中，超過65％的病人會(huì)有局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。[1]很不幸的是，少于15％的肺癌患者能夠存活超過5年。[2]在過去的十幾年中，特定基因突變檢測(cè)在肺癌中的應(yīng)用，引領(lǐng)肺癌治療進(jìn)入新的靶向時(shí)代。針對(duì)EGFR及ALK(anaplastic lymphomakinase)在肺癌治療中帶來很好的療效。EGFR-TKI在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌及crizotinib在AL

2、K重排的非小細(xì)胞肺癌中的治療反應(yīng)，生存質(zhì)量，無進(jìn)展生存期相比較于化療而言，都有很大的提升。[3-5]
　　EGFR-TKI如吉非替尼，厄洛替尼，阿法替尼已被確立為主要的標(biāo)準(zhǔn)治療。[6-9]這些治療尤其在EGFR突變（外顯子19位缺失突變，L858異位突變）的非小細(xì)胞肺癌中效果顯著。[10]亞洲肺腺癌患者中超過50％會(huì)發(fā)現(xiàn)EGFR突變。盡管大部分的EGFR突變肺癌患者在應(yīng)用TKI初期效果顯著，但是都不可避免的發(fā)生獲得性抵抗。[11]

3、因此固有耐藥和獲得性耐藥成為影響患者療效的重要障礙。
　　目前，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)EGFR-TKI耐藥機(jī)制。近期的研究中，新一代的EGFR-TKI在EGFR T790M突變（約占耐藥腫瘤的50％）的肺癌中有取得了較好的療效。[12-14]而之前我們的研究報(bào)道HGF作為MET受體的配體，會(huì)誘導(dǎo)EGFR突變的肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼或是新一代EGFR-TKIs抵抗，這一現(xiàn)象是通過MET/Gab1/PI3K/AKT途徑實(shí)現(xiàn)的，而不需要經(jīng)過ErbB3

4、，盡管ErbB3在MET擴(kuò)增導(dǎo)致的吉非替尼抵抗中有重要作用。[15]我們同時(shí)又發(fā)現(xiàn)，MET抑制劑E7050可以成功克服HGF誘導(dǎo)的EGFR-TKI抵抗。[16]
　　對(duì)于野生型的EGFR進(jìn)展期肺癌患者而言，化療是主要的治療手段。然而，隨著治療的進(jìn)行常常會(huì)發(fā)生化療抵抗，這會(huì)大大降低病人對(duì)化療的臨床受益度。盡管EGFR-TKI在EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中的效果尚有爭(zhēng)議，但是很多臨床試驗(yàn)顯示，在化療后進(jìn)展的患者中，使用EGFR-

5、TKI可以獲得一定的生存獲益[17-19]。因此，某些指南推薦在EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中，EGFR-TKI可作為可選擇的二線治療手段?？紤]到不可避免的藥物抵抗，我們猜想這些耐藥機(jī)制也可能存在于野生型EGFR突變的肺癌中，如果可以在EGFR-TKI治療前就考慮到潛在的耐藥并進(jìn)行處理，那么這類病人可能將從EGFR-TKI治療中獲得更多的受益。
　　由于之前在EGFR突變的肺癌細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)HGF/MET是一個(gè)重要的導(dǎo)致EGF

6、R-TKI耐藥的機(jī)制，因此本研究中我們進(jìn)一步研究了HGF是否也會(huì)導(dǎo)致EGFR野生型腫瘤耐藥。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HGF通過PI3K/Akt，MAPK途徑顯著降低EGFR野生型肺癌細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性。小分子MET抑制劑，PHA-665752完全逆轉(zhuǎn)了HGF導(dǎo)致的EGFR-TKI耐藥。[23]我們的研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用EGFR-TKI和MET抑制劑或者抑制下游信號(hào)分子PI3K、MEK，可能是EGFR野生型肺癌患者可選擇的二、三線治療策略

7、。
　　方法:
　　1.EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性的檢測(cè)
　　檢測(cè)EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞A549，H358對(duì)EGFR-TKI的敏感性。這兩株細(xì)胞均為KRAS突變細(xì)胞。依據(jù)MTT使用說明書，檢測(cè)A549和H358細(xì)胞在不同濃度的EGFR-TKI（吉非替尼和厄洛替尼）下，細(xì)胞的增殖情況。HGF處理后EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性的檢測(cè)應(yīng)用HGF提前處理細(xì)胞30分鐘后，加入不同濃度的

8、EGFR-TKI gefitinib，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，依據(jù)MTT使用說明書，檢測(cè)在有HGF存在情況下兩種EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞A549，H358對(duì)吉非替尼的敏感性變化;同時(shí)應(yīng)用HGF中和性抗體預(yù)處理，檢測(cè)其是否能夠恢復(fù)這兩種細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性;聯(lián)合應(yīng)用MET小分子抑制劑PHA-665752，檢測(cè)其是否能夠恢復(fù)HGF處理后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。
　　檢測(cè)EGFR野生型細(xì)胞中MET，EGFR，ErbB3的表達(dá)情況。

9、>　　提取EGFR野生型細(xì)胞A549，H358的總蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，配置同等蛋白濃度樣品后，加入SDS-PAGE loading buffer經(jīng)95攝氏度高溫加熱后進(jìn)行蛋白變性，進(jìn)而通過凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉后，4攝氏度孵育一抗過夜，室溫孵育二抗，經(jīng)洗膜后，采用ECL法檢測(cè)這兩種細(xì)胞的MET，EGFR, ErbB3及其下游信號(hào)的蛋白表達(dá)情況。
　　2.檢測(cè)吉非替尼和/或HGF和/或MET抑制劑處理后A549，H

10、358細(xì)胞中MET，EGFR, ErbB3及其下游信號(hào)蛋白的表達(dá)情況。
　　同樣利用Westem blotting方法檢測(cè)各種處理后，EGFR野生型細(xì)胞株中MET，EGFR，ErbB3及其下游信號(hào)的蛋白表達(dá)情況。
　　3.檢測(cè)MET，EGFR，ErbB3三者之間的關(guān)系
　　利用免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)HGF和或吉非替尼處理后的MET與EGFR，ErbB3三者之間的關(guān)系。
　　4.檢測(cè)特異性敲除MET或特異性敲除ErbB3

11、能否恢復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性
　　利用陽離子脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染EGFR野生型細(xì)胞A549和H358，按照lip2000使用說明書進(jìn)行操作，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％時(shí)，轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基Opti-MEMI稀釋scramble，MET siRNA，ErbB3 siRNA，以及l(fā)ipofectamine2000，轉(zhuǎn)染用SIRNA稀釋液與lipofectamine2000稀釋液分別混合后，室溫靜置20分鐘，加入貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)

12、孵育4-6小時(shí)后，細(xì)胞換液，換成含有抗生素的完全培養(yǎng)基，則轉(zhuǎn)染完成。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)進(jìn)行對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，WesternBlotting檢測(cè)其相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況以及下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的EGFR野生型細(xì)胞A549和H358對(duì)吉非替尼的敏感情況。
　　5.檢測(cè)高表達(dá)HGF后的EGFR野生型細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的敏感性變化
　　構(gòu)建高表達(dá)HGF基因的肺腺癌細(xì)胞株。同siRNA轉(zhuǎn)染相同，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體的方法攜

13、帶HGF基因，轉(zhuǎn)染EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞。當(dāng)轉(zhuǎn)染完成后，應(yīng)用人HGF ELISA檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)轉(zhuǎn)入HGF基因前后的細(xì)胞分泌HGF的情況。同時(shí)利用轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同上，按照MTT的操作執(zhí)行。
　　結(jié)果:
　　1.EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的中度敏感
　　兩種EGFR野生型細(xì)胞A549，H358經(jīng)不同濃度的EGFR-TKI（吉非替尼，厄洛替尼）處理，經(jīng)MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖

14、活力。結(jié)果顯示，兩種EGFR-TKI藥物對(duì)EGFR野生型細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出中等抑制作用。
　　2.HGF降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性
　　HGF提前處理EGFR野生型細(xì)胞30分鐘后再用不同濃度的吉非替尼處理A549、H358細(xì)胞，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)HGF處理后的細(xì)胞對(duì)吉非替尼產(chǎn)生抵抗作用;若同時(shí)應(yīng)用HGF中和性抗體/空白IgG作用HGF處理后的細(xì)胞，再檢測(cè)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用了HGF中和性抗體后的細(xì)胞會(huì)恢

15、復(fù)細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，而使用空白抗體的細(xì)胞則仍對(duì)吉非替尼耐藥。這就說明HGF會(huì)降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。
　　3.EGFR野生型細(xì)胞中表達(dá)MET，EGFR，ErbB3
　　通過western blotting檢測(cè)到EGFR野生型細(xì)胞A549，H358細(xì)胞中均表達(dá)MET，EGFR，ErbB3并且有不同程度的磷酸化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其下游信號(hào)蛋白AKT及ERK1/2亦有磷酸化。
　　4.HGF通過MET介導(dǎo)下游

16、信號(hào)蛋白AKT及ERK1/2的活化降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性
　　Western blotting檢測(cè)各種處理組后的蛋白顯示，吉非替尼可以明顯抑制MET，EGFR，ErB3，Akt及ERK1/2的磷酸化。單獨(dú)HGF或PHA-665257處理均不能影響EGFR，ErB3的磷酸化。然而HGF可以激活MET，MET的磷酸化會(huì)被PHA-665257抑制。重要的是，即使在吉非替尼存在的情況下，HGF亦可以恢復(fù)Akt及ERK1/

17、2的活化，但不能影響EGFR，ErB3的活化。進(jìn)一步聯(lián)合PHA-665257和吉非替尼會(huì)抑制MET活化，并同時(shí)抑制下游Akt及ERK1/2的磷酸化。這些結(jié)果表明，與EGFR突變的肺癌細(xì)胞相同，HGF導(dǎo)致EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性下降是通過MET介導(dǎo)的下游Akt及ERKI/2的活化實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論:
　　1.HGF降低EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性
　　2.HGF降低EGFR野生型細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏