槐定堿對(duì)內(nèi)毒素肺損傷小鼠LPS識(shí)別受體及P38MAPK-AP-1信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的： 建立小鼠內(nèi)毒素（即脂多糖，LPS）急性肺損傷（ALI）模型，動(dòng)態(tài)觀察槐定堿對(duì)小鼠內(nèi)毒素性肺損傷模型的治療作用，研究槐定堿對(duì)LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的識(shí)別受體-LBP、CD14、TLR4、胞內(nèi)p38MAPK信號(hào)分子、核轉(zhuǎn)錄因子AP-1及主要炎癥介質(zhì)TNF-a、NO四個(gè)層次的影響，以探討其抗內(nèi)毒素的藥理機(jī)制。 方法： BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組、內(nèi)毒素肺損傷模型組、槐定堿治療組[槐定堿高（12mg

2、/kg）、中（6mg/kg）、低（3mg/kg）三個(gè)劑量]、槐定堿藥物對(duì)照組（12mg/kg ）。每組小鼠再分為2h、6h、12h、24h 四個(gè)時(shí)相。以尾靜脈注射內(nèi)毒素7mg/kg 制備急性肺損傷小鼠模型。各組小鼠分別在給予 LPS 或槐定堿后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，即2h、6h、12h、24h時(shí)記錄一般狀況并取材，肉眼及光鏡觀察肺組織的病理變化；以肺濕/干重（W/D ）比值檢測(cè)肺水含量；硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮(NO)含量；放射免疫分析法檢測(cè)

3、血清腫瘤壞死因子（TNF-a）含量；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)肺組織中LBP、CD14、TLR4、c-jun、c-fos及TNF-a的mRNA 表達(dá)水平；免疫組化SP法與免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)肺組織中總p38MAPK、磷酸化p38 MAPK、TLR4蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果： （1 ）內(nèi)毒素肺損傷模型組小鼠在給予LPS 后30 分鐘即有癥狀出現(xiàn)，至24h未見(jiàn)緩解；肉眼與光鏡觀察肺臟病理改變，

4、發(fā)現(xiàn)6h 起肺臟病理改變明顯可見(jiàn)并逐漸加重，延至24h 亦未見(jiàn)減輕；模型鼠肺組織W/D 值顯著升高；血清TNF-a和NO 值均在給予LPS 后2h 即顯著升高，并分別在6h和12h 達(dá)到高峰，直至24h 仍明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01）。模型組肺組織LBPmRNA、CD14mRNA 與TLR4mRNA 表達(dá)均在 2h 開(kāi)始上調(diào)，于6h 達(dá)高峰，至24h 仍維持高水平。TLR4蛋白表達(dá)趨勢(shì)與TLR4mRNA大致相似。免疫組化檢測(cè)模型組

5、各時(shí)相點(diǎn)的p38 陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在氣道黏膜上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中；磷酸化p38 在上述細(xì)胞的胞漿與胞核中均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性信號(hào)均較正常對(duì)照組明顯增多和增強(qiáng)，各時(shí)相點(diǎn)記分值均顯著高于同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組（P<0.01 或P<0.05 ）。Western-blot檢測(cè)模型組總p38蛋白，僅在2h、6h時(shí)相點(diǎn)較正常對(duì)照組顯著增高（P<0.05和P<0.01）；而磷酸化p38 在正常對(duì)照組與槐定堿對(duì)照組均表達(dá)

6、極低（未統(tǒng)計(jì)），模型組在LPS 刺激后2h迅速達(dá)到高峰，持續(xù)至6h，隨后開(kāi)始降低，至24h 仍有表達(dá)。模型組肺組織中c-jun mRNA表達(dá)在2h 開(kāi)始上調(diào)，6h 與12h時(shí)繼續(xù)升高，與同時(shí)相正常組比較差異顯著（P<0.01），但24h 已降至正常水平；模型組c-fos mRNA 表達(dá)2h 即達(dá)頂峰，隨后開(kāi)始下降，但均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01 或P<0.05），24h時(shí)降至正常水平。肺組織中TNF-a mRNA變化趨勢(shì)與血清TN

7、F-a基本一致。 （2 ）槐定堿三個(gè)劑量均不同程度改善內(nèi)毒素性肺損傷小鼠的一般狀況，減輕肺組織病理?yè)p傷，明顯降低肺組織W/D 值；除2h 低劑量組外，槐定堿三個(gè)劑量治療組血清NO 含量均顯著低于同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組（均P<0.01）；槐定堿中、高劑量治療組小鼠血清TNF-a 水平均顯著低于同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組（P<0.01 或P<0.05）。與LPS模型組比較，槐定堿三個(gè)劑量治療組均不同程度顯著下調(diào)同時(shí)相點(diǎn)LBP、CD14、TL

8、R4的mRNA以及TLR4蛋白的表達(dá)；免疫組化檢測(cè)槐定堿三個(gè)劑量治療組肺組織總p38，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度的記分值與同時(shí)相點(diǎn)LPS組比較均無(wú)顯著差異；但磷酸化p38陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，陽(yáng)性信號(hào)明顯減弱，記分值均顯著小于同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組(P<0.01 或P<0.05)。Western-blot檢測(cè)槐定堿三個(gè)劑量組肺組織總p38蛋白表達(dá)均與模型組無(wú)顯著差異，但槐定堿三個(gè)劑量治療組2h 起即有下調(diào)磷酸化p38蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，6h 與12

9、h時(shí)與同時(shí)相點(diǎn)模型組比較均有顯著下降（P<0.01 或P<0.05）。槐定堿三個(gè)劑量治療組均不同程度顯著下調(diào)c-jun和c-fos的mRNA表達(dá)（P<0.01 或P<0.05 ）?；倍▔A三個(gè)劑量治療組TNF-a mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化與血清TNF-a類(lèi)似?；倍▔A三個(gè)劑量治療組之間比較，在6h、12h 及24h時(shí)相點(diǎn)，中、高劑量組TNF-a mRNA表達(dá)均顯著低于同時(shí)相點(diǎn)低劑量組（P<0.01 或P<0.05），說(shuō)明槐定堿中、高劑量組下調(diào)

10、TNF-a mRNA的效應(yīng)強(qiáng)于低劑量組。 結(jié)論： （1）獲得內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠模型24h 內(nèi)一般狀況、肺水含量、肺組織病理?yè)p傷情況、血清NO、TNF-a 含量、肺組織LBP、CD14、TLR4、c-jun、c-fos 及TNF-a mRNA 表達(dá)水平、肺組織TLR4、總p38 與磷酸化p38蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)。（2）槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（3mg/kg）三個(gè)劑量對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷小鼠模型

11、具有治療效應(yīng)。（3）槐定堿的抗內(nèi)毒素肺損傷機(jī)制與下調(diào)LPS 識(shí)別受體LBP、CD14、TLR4 表達(dá)，抑制肺組織中p38 MAPK的磷酸化，干預(yù)核因子c-jun和c-fos基因的轉(zhuǎn)錄，抑制下游炎癥因子TNF-a、NO的釋放有關(guān)。（4）在本研究中，槐定堿下調(diào)TNF-a 表達(dá)的作用具有劑量依賴性，即中、高劑量的效應(yīng)強(qiáng)于低劑量?；倍▔A三個(gè)劑量組之間其余觀測(cè)指標(biāo)均無(wú)顯著的劑量依賴性。（5）本研究中槐定堿藥物對(duì)照組與正常對(duì)照組之間所有檢測(cè)數(shù)據(jù)均無(wú)