催產(chǎn)素和血管加壓素對(duì)健康雄性大鼠胃運(yùn)動(dòng)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：催產(chǎn)素對(duì)健康雄性大鼠胃運(yùn)動(dòng)的影響及其機(jī)制研究 目的： 催產(chǎn)素（oxytocin，OT）是由下丘腦視上核和室旁核合成并儲(chǔ)存于神經(jīng)垂體的激素。已有資料表明OT能影響胃腸道的活動(dòng)，由于動(dòng)物種屬差異、檢測(cè)部位不同等原因，不同研究組報(bào)道的有關(guān)OT影響胃腸道活動(dòng)的結(jié)果并不一致，OT影響胃腸道運(yùn)動(dòng)的受體后機(jī)制也不清楚。Monstein等報(bào)道在人類(lèi)胃腸道有催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，OTR）mRNA表達(dá)，但

2、表達(dá)于何種細(xì)胞并不清楚。本研究旨在弄清OT對(duì)胃收縮活動(dòng)的影響，定位消化道上OTR并探討OT引起胃收縮的受體后機(jī)制。 方法： 胃內(nèi)壓記錄:2％戊巴比妥鈉（56 mg/kg）麻醉大鼠，依次行氣管插管、頸靜脈插管和股動(dòng)脈插管。將一塑料氣囊從食管插入胃腔后固定。氣囊內(nèi)注入生理鹽水使胃內(nèi)基礎(chǔ)壓力維持在30 mmHg左右。大鼠胃收縮活動(dòng)穩(wěn)定1小時(shí)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。觀察阻斷劑效應(yīng)時(shí)，注射阻斷劑10分鐘后再注射OT。 胃離體肌條張力記

3、錄:快速犧牲大鼠，取出胃放置于4℃ krebs液中。沿胃小彎剪開(kāi)胃腔，在胃各部位沿纖維走向剪4條肌條（4 mm×10 mm），分別為：胃體環(huán)行肌、胃體縱行肌、胃竇環(huán)行肌和幽門(mén)管環(huán)行肌。小心去除粘膜。將肌條分別放置在含有5ml krebs液（37℃）的浴槽中孵育，并每隔15分鐘更換浴槽中krebs液。待肌條自發(fā)收縮穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。 平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度測(cè)量:犧牲大鼠后取出胃體，去除粘膜和漿膜。將肌條剪成2 mm×2 mm小塊并轉(zhuǎn)移到8

4、ml含有0．1％Ⅱ型膠原酶和0．01％胰酶抑制劑的31℃hepes-ringer液中消化，共消化兩次，每次45分鐘。消化完后用無(wú)酶hepes-ringer液沖洗3次后將組織置于5 ml新鮮hepes-ringer液中振蕩30分鐘，用500μm的細(xì)胞篩過(guò)濾收集單個(gè)平滑肌細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度。每個(gè)培養(yǎng)皿只觀察一個(gè)細(xì)胞。 將胃體肌條勻漿后12％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulf

5、ate polyacrylamide gel electropHeresis，SDS-PAGE）電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（nitrocellulose blotting membranes，NC）上。5％脫脂奶粉室溫下封閉1小時(shí)，TTBS（tris buffer saline with tween-20）沖洗3次后將NC膜和一抗（1：400）共孵育，4℃過(guò)夜。TTBS沖洗三次后室溫下將膜與HRP標(biāo)記二抗（1：20000）共

6、孵育一小時(shí)。洗去二抗，ECL顯影。 免疫組織化學(xué)技術(shù):新鮮胃標(biāo)本冰凍切片，厚10μm。3％H2O2－甲醇溶液去掉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5％兔血清封閉。加入山羊抗OTR多克隆抗體（1：100）4℃過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液（pHospHate buffer solution，PBS）沖洗三次后滴加生物素標(biāo)記兔抗羊IgG工作液室溫孵育30分鐘，沖洗后再滴加辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記鏈酶卵白素工

7、作液室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次。3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）鏡下顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。 統(tǒng)計(jì)分析:在整體實(shí)驗(yàn)中，以胃位相性收縮峰值的平均值為觀察指標(biāo)。注射OT前3分鐘峰值的平均值為基礎(chǔ)值，注射OT后不同時(shí)間段峰值的平均值為效應(yīng)值，效應(yīng)值與基礎(chǔ)值的差值作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。在離體肌條實(shí)驗(yàn)中，以肌條平均張力為觀察指標(biāo)，加入OT前3分鐘的平均張力為基礎(chǔ)值，加入OT后

8、不同時(shí)間段的平均張力為效應(yīng)值，效應(yīng)值與基礎(chǔ)值的比值為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)R。 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0．05為顯著性差異界值。 結(jié)論： OT對(duì)胃運(yùn)動(dòng)具有緊張性興奮作用；外源性O(shè)T引起胃自發(fā)收縮活動(dòng)先抑制后興奮，其中抑制效應(yīng)是通過(guò)CCK釋放引起的，而興奮效應(yīng)是通過(guò)作用于胃平滑肌細(xì)胞上的OTR引起的，并由IP3介導(dǎo)。 第二部分：血管升壓素對(duì)健康雄性大鼠胃平滑肌

9、肌條收縮活動(dòng)的影響及其機(jī)制研究 目的： 血管升壓素（vasopressin，VP）也是神經(jīng)垂體激素。盡管OT和VP在結(jié)構(gòu)上具有80％的同源性，且高濃度時(shí)都能與對(duì)方的受體結(jié)合，但兩種激素卻有各自的生理學(xué)功能。VP的生理作用主要是促進(jìn)腎集合管對(duì)水的重吸收，當(dāng)機(jī)體大失血時(shí)，VP濃度急劇升高，引起血管收縮。有資料表明VP也能影響胃腸道的活動(dòng)，Monstein等報(bào)道在人類(lèi)胃腸道有血管升壓素受體（vasopressin recept

10、or，VPR）mRNA的表達(dá)，但何種細(xì)胞表達(dá)該受體并不清楚。本研究旨在探討VP對(duì)胃收縮活動(dòng)的影響是否與OT有所不同，并定位消化道上VP受體。 方法： 胃離體肌條張力記錄 同第一部分。 免疫組織化學(xué)技術(shù):新鮮胃體標(biāo)本冰凍切片，厚10μm。3％H2O2－甲醇溶液去掉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5％兔血清封閉。滴加山羊抗V1a受體多克隆抗體（1：100）4℃過(guò)夜。然后滴加兔抗山羊IgG抗體-HRP多聚體孵育30分鐘，

11、PBS沖洗3次。DAB鏡下顯色。 V1a受體和NeuN免疫熒光雙標(biāo):4％多聚甲醛固定胃標(biāo)本，石蠟切片厚4μm。常規(guī)脫蠟，水化。枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，5％兔血清封閉。同時(shí)滴加山羊抗V1a受體多克隆抗體（1：100）和小鼠抗神經(jīng)元細(xì)胞核（neuronal nuclei，NeuN）單克隆抗體（1：100）4℃過(guò)夜。然后同時(shí)滴加四甲基異氰酸羅達(dá)明（TRITC）標(biāo)記兔抗山羊IgG（1：50）和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記兔抗小鼠IgG（1