北京地區(qū)人偏肺病毒全基因組序列、血清流行率分析及B細(xì)胞表位研究.pdf

1、急性呼吸道感染是導(dǎo)致人類,特別是兒童致病和死亡的重要病因。病毒在呼吸道感染中扮演重要角色,近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不斷有新的病毒發(fā)現(xiàn),尤其是SARS和甲型H1N1流感病毒的出現(xiàn),進(jìn)一步提示加強(qiáng)新發(fā)病毒性傳染病研究的重要性。
　　 人偏肺病毒(HMPV)是2001年從下呼吸道感染兒童的呼吸道樣本中分離出來的一種新的病毒。目前,將HMPV歸為副粘病毒科,肺病毒亞科偏肺病毒屬。HMPV可感染各年齡人群,癥狀重者多發(fā)于嬰幼兒,老

2、年人,免疫抑制人群,可導(dǎo)致上呼吸道和下呼吸道疾病。HMPV的感染存在地區(qū)和時(shí)間差異。目前,HMPV在我國(guó)的流行率尚不清楚,尤其是基于全基因組測(cè)序的分子特征研究尚少。此外,缺乏快速有效的診斷HMPV感染的技術(shù)。為此,本研究對(duì)北京地區(qū)HMPV毒株的基因特征和及近年全人群中的血清流行率進(jìn)行了研究,并首次對(duì)HMPV F蛋白的線性表位進(jìn)行了篩選,為闡明我國(guó)HMPV的流行特征和開發(fā)特異性免疫診斷技術(shù)提供基礎(chǔ)。
　　 一、北京地區(qū)HMPV全基

3、因組序列測(cè)定與分析
　　 利用RT-PCR方法,對(duì)2007年3月-2009年4月期間收集的1542份兒童咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè),HMPV檢出率為2.8％。隨機(jī)選取4份HMPV陽性樣本,采用隨機(jī)PCR方法擴(kuò)增后,對(duì)其進(jìn)行了鳥槍法測(cè)序,獲得了全基因組序列。序列分析和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,四株均屬于A2基因型,與國(guó)外代表株屬于不同進(jìn)化分支。4株HMPV F序列與A型(A1/A2亞型)HMPV F序列同源性較高,核苷酸序列同源性分別為97.

4、3-99.8和92.1-93％,而氨基酸序列同源性分別為95.2-100％和94.4-98.5％；與B型(B1/B2)HMPV F蛋白序列同源性較低；4株HMPV實(shí)驗(yàn)株G蛋白高變區(qū)編碼核苷酸序列與DQ843659的相應(yīng)區(qū)域有相對(duì)較高保守性,而與其他3株亞型代表株相比,序列保守性較差。
　　 二、北京地區(qū)正常人群HMPV感染血清流行率研究
　　 利用大腸桿菌系統(tǒng),對(duì)HMPV N蛋白進(jìn)行了表達(dá),經(jīng)過金屬螯合層析純化,其純度達(dá)

5、到90％以上。利用該抗原建立了ELISA方法,對(duì)不同年齡組人群血清中的抗HMPVIgG抗體流行率進(jìn)行了研究。對(duì)1157份正常人群血清的篩查表明,HMPV在人群中感染普遍,≤6個(gè)月人群中抗體陽性率為66.67％以上,6月-1歲年齡組略有降低(58.6％),1-2歲為73.47％,隨著年齡的增長(zhǎng),抗體陽性率逐漸升高,至20歲之后抗體陽性率達(dá)到了100％。相比而言,人呼吸道合胞病毒(RSV)血清抗體IgG抗體水平在≤6月時(shí)抗體陽性率為71.4

6、0％,6個(gè)月-1歲抗體陽性率為84.48％,1-2歲為85.8％,抗體水平隨著年齡增高。到20歲以后,抗體水平達(dá)到100％。這些數(shù)據(jù)提示,HMPV在新生兒和嬰兒期的感染率可能低于RSV。
　　 三、HMPV F蛋白B細(xì)胞表位分析
　　 將HMPV和RSV的F、N蛋白基因分別插入重組腺病毒載體,獲得了表達(dá)兩種蛋白的4種重組腺病毒。分別將4種腺病毒以滴鼻形式免疫小鼠,制備抗HMPV和RSV的人偏肺病毒和人呼吸道合胞病毒的N蛋

7、白以及F蛋白的抗血清。利用獲得的小鼠血清分別與HMPV和RSV的F和N蛋白反應(yīng),可見HMPV和RSV之間存在交叉免疫反應(yīng)。利用獲得的小鼠血清和HMPV IgG陽性人血清,利用55條合成肽,通過Pepscan分析技術(shù),對(duì)HMPV F蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果顯示,33條多肽可與人血清反應(yīng),其中12條多肽可與小鼠抗RSV F蛋白血清反應(yīng),其中10條與人血清篩選結(jié)果重疊。說明二者存在交叉性表位。
　　 綜上所述,本研究通過了