人硫氧還蛋白及突變體的構(gòu)建、表達及其在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血性心臟病嚴重威脅著人類的健康。由于溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)等治療措施的廣泛應(yīng)用，使得缺血心肌能及時有效的恢復血供，可使缺血性心臟病患者的死亡率大為減少。但隨之而來的心肌缺血再灌注損傷，不僅影響血運再通的療效，甚至可導致死亡。心肌缺血再灌注損傷的機制復雜，心肌細胞凋亡因其可逆性而在心肌缺血再灌注損傷中具有重要的地位。
　　硫氧還蛋白（Trx）是一種廣泛分布的控制細胞還原/氧化狀態(tài)和細胞增殖/生存的小分子蛋白

2、質(zhì)，它與多種心血管疾病都有密切的關(guān)系，它除了基本的氧化還原調(diào)節(jié)功能外，還具有多種生物學活性，如抗炎、抗細胞凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，Trx可直接與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）結(jié)合而抑制其活性；也可通過清除活性氧、與線粒體基質(zhì)中的CtyC形成復合物而抑制凋亡信號的傳遞，從而間接抑制凋亡；還可通過硝基化修飾、亞硝基化修飾這種蛋白翻譯后修飾的方式調(diào)節(jié)硫氧還蛋白對細胞凋亡的調(diào)控。然而，其凋亡的抑制機制仍未完全闡明。
　　研究發(fā)現(xiàn)，Trx的氧化還

3、原調(diào)節(jié)功能是通過其活性中心位點Cys32-Gly-Pro-Cys35（CGPC）中的二硫鍵和巰基的互變來實現(xiàn)的。人Trx的結(jié)構(gòu)除具有CGPC活性中心外，還含有3個Cys殘基（Cys62、69、73）及1個Tyr-49殘基。它們在Trx的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)，Tyr49發(fā)生硝基化修飾后，Trx的抗凋亡作用減弱； Cys-69被亞硝基化修飾后，Trx的抗凋亡能力得到增強；Cys62可介導Cys69、73的亞硝基化修飾；Cys7

4、3亞硝基化修飾后可通過轉(zhuǎn)亞硝基作用于caspase3，抑制細胞凋亡。但也有學者發(fā)現(xiàn)，Trx在高濃度的S-亞硝基化谷胱甘肽(如1 mmol／L)作用下，可能導致包括催化中心在內(nèi)的其他Cys的亞硝基化，甚至干擾Trx與ASK1的結(jié)合，而誘導細胞凋亡。因此推測不同的半胱氨酸殘基對亞硝基化修飾的敏感度不同，而不同位點的硝基化、亞硝基化狀態(tài)可能對Trx發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。進一步闡明硝基化、亞硝基化修飾對Trx結(jié)構(gòu)和功能的影響及其調(diào)節(jié)凋亡保護心肌的

5、機制，將為Trx應(yīng)用于臨床預防和治療心肌缺血再灌注損傷有重要的意義。
　　實驗目的：
　　1.獲得正確的pET-45b-hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S載體，表達出相應(yīng)具有生物學活性的蛋白。
　　2.觀察hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S突變體及分別給予硝基、亞硝基化修飾后對小鼠心肌缺血再灌注損傷中心肌細胞凋亡、心肌梗死面積的影響。
　　3.獲

6、得正確的“rAd-ASK1”腺病毒包裝質(zhì)粒。
　　實驗方法：
　　1．應(yīng)用RT-PCR方法獲得hTrx全長cDNA，將DNA片段和空載體pET-45b進行酶切連接，采用環(huán)狀定點誘變方法對hTrx基因進行定點突變，獲得正確的pET-45b-hTrx、hTrx C32S、hTrx Y49F和hTrx C69S載體，分別進行轉(zhuǎn)化，誘導表達。經(jīng) Ni-NTA柱純化、內(nèi)毒素親和柱去除內(nèi)毒素后獲得具有生物學活性的野生型和突變型hTrx蛋

7、白。
　　2．制備小鼠缺血再灌注模型，分別用PBS，hTrx，硝基、亞硝基C32S hTrx，亞硝基C69S hTrx，硝基Y49F hTrx干預，再灌注3 h，分別檢測心肌細胞凋亡(TUNEL染色)和Caspase-3活性。再灌注24 h后，測定心肌梗死范圍（伊文氏藍－TTC染色）。
　　3．應(yīng)用基因克隆及重組技術(shù)，將 ASK1基因的CDS區(qū)分段構(gòu)建至穿梭載體pYr-ads-1-FLAG-N上。
　　實驗結(jié)果：

8、>　　1．成功構(gòu)建了野生型hTrx，及C32S，C69S和Y49F突變體的載體質(zhì)粒，其所誘導表達的蛋白具有活性，符合下一步實驗需求。
　　2．建立小鼠缺血再灌注模型，分別腹腔注射不同劑量的重組hTrx，C32S，C69S和Y49F蛋白，觀察到：（1）C32S突變體降低MIRI導致的細胞凋亡和心梗范圍的作用較野生型弱；硝基化修飾后其上述作用減弱；而亞硝基化修飾后其上述作用增強；（2）Y49F突變體對MIRI導致的細胞凋亡和心梗范圍保

9、護作用較野生型hTrx無顯著性差異，硝基化修飾不能增加其細胞凋亡數(shù)目和心梗范圍面積；（3）C69S突變體對MIRI導致的細胞凋亡和心梗范圍保護作用較野生型hTrx無顯著性差異，但亞硝基化修飾不能增強其保護作用。
　　3．獲得了正確的“rAd-ASK1”腺病毒。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建了野生型hTrx，及C32S，C69S和Y49F突變體的載體，經(jīng)原核表達、純化、去除內(nèi)毒素獲得相應(yīng)具有生物活性的蛋白。