小鼠胚胎干細胞定向誘導分化為胰島樣細胞過程中Kcnq1、Cdkn1c基因印記變化及其機理研究.pdf

1、論文分為二章：
　　 第一章：小鼠胚胎干細胞SF1-G定向誘導分化為胰島樣細胞過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達研究
　　 目的：體外誘導小鼠胚胎干細胞SF1-G定向誘導分化為胰島樣細胞，觀察誘導分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記變化，探討胚胎干細胞體外誘導分化培養(yǎng)過程中表觀遺傳學的穩(wěn)定性。
　　 方法：
　　 1.從孕小鼠胚胎分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞，絲裂霉素C處理第3-5代小

2、鼠胚胎成纖維細胞制備飼養(yǎng)層細胞，在飼養(yǎng)層細胞上擴增培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞株SF1-G細胞。
　　 2.參照Shi等人的三階段法，定向誘導小鼠胚胎干細胞SF1-G向胰島樣細胞分化；細胞免疫熒光染色和RT-PCR檢測分化細胞中胰島細胞特異性標志物的表達。
　　 3.在誘導分化培養(yǎng)的不同階段收集細胞，逆轉錄-聚合酶鏈式反應/限制性內切酶片段長度多態(tài)性(RT-PCR/RFLP)檢測印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達的親本來源，分析

3、其印記狀態(tài)。
　　 結果：
　　 1.SF1-G細胞能在飼養(yǎng)層細胞上保持未分化狀態(tài)增殖培養(yǎng)。
　　 2.RT-PCR結果顯示，在誘導分化的第三階段，細胞逐漸出現(xiàn)胰島細胞特異性基因的表達；細胞免疫熒光結果顯示，分化終末細胞可表達胰島細胞特異性激素蛋白，證實成功將胚胎干細胞誘導分化為胰島樣細胞。
　　 3.RT-PCR/RFLP分析結果顯示，誘導分化后的細胞印記基因Kcnq1、Cdkn1c從母源單等位基因表達

4、轉變成雙等位基因表達，出現(xiàn)印記丟失(LOI)，而持續(xù)傳代培養(yǎng)的ES細胞中Kcnq1、Cdkn1c仍表現(xiàn)為母源單等位基因表達，即印記保持(MOI)。
　　 結論：
　　 1.參照Shi等人的方法，我們能將小鼠胚胎干細胞體外定向誘導培養(yǎng)分化為胰島樣細胞。
　　 2.是誘導分化培養(yǎng)作用，而不是單純的細胞傳代培養(yǎng)過程導致印記基因表達異常，出現(xiàn)印記丟失，即細胞誘導分化培養(yǎng)過程導致了表觀遺傳性狀的不穩(wěn)定。
　　 第二

5、章：小鼠胚胎干細胞SF1-G定向誘導分化為胰島樣細胞過程中KνDMR1甲基化及Dmnt表達研究
　　 目的：觀察胚胎干細胞SF1-G在誘導分化前后印記基因Kcnq1、Cdkn1c印記調控區(qū)(ICR)差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的甲基化狀態(tài)，以及分化各階段細胞中DNA甲基轉移酶水平變化，以探討胚胎干細胞在體外誘導分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdkn1c表達變化的機理。
　　 方法：
　　 1.重亞硫酸鹽P

6、CR測序法檢測分化前后Kcnq1、Cdkn1c基因印記調控區(qū)KνDMR1的CpG位點甲基化狀態(tài)：1)收集未分化的細胞及誘導分化終末的細胞，提取基因組DNA，重亞硫酸鹽處理DNA，以特異性引物PCR擴增差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1；2)將PCR產物連接到氨芐抗性T載體質粒后轉入感受態(tài)細菌，用不含氨芐的LB培養(yǎng)基搖菌后均勻涂在氨芐瓊脂糖平板上，次日挑取陽性細菌克隆，用含氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽性細菌；3)PCR驗證細菌中存在目的片段后，將

7、菌液送送上海生工生物工程公司測序，測序結果通過軟件進行分析，了解分化前后細胞的KνDMR1的甲基化狀態(tài)。
　　 2.Westernblot檢測誘導分化各階段細胞中DNA甲基轉移酶Dmnt1和Dmnt3b的表達水平。
　　 結果:
　　 1.測序檢測了KνDMRl區(qū)23個CpG位點的甲基化狀態(tài)，在分化前的胚胎干細胞中，9個測序結果顯示，有4個表現(xiàn)為1-23個CpG位點全部甲基化，另外5個表現(xiàn)為所有CpG位點都未甲基

8、化，即KνDMR1區(qū)的CpG位點表現(xiàn)為全甲基化或全未甲基化，符合印記調控區(qū)域差異性DNA甲基化區(qū)(DMR)的特點；而在分化后的細胞中，11個測序結果顯示，其中5個表現(xiàn)為1-23個CpG位點全部甲基化，4個在第18-23個CpG位點發(fā)生甲基化，而其余CpG位點未甲基化，其余2個表現(xiàn)為所有CpG位點都未甲基化，提示原來未甲基化的KνDMR1發(fā)生了甲基化。
　　 2.Westernblot結果顯示，胚胎干細胞誘導分化后，從第二階段開始

9、DNA甲基轉移酶Dmnt1水平顯著升高；DNA甲基轉移酶Dmnt3b在第三階段也顯著升高，而同期傳代培養(yǎng)的未分化細胞DNA甲基轉移酶水平沒有明顯變化。
　　 結論:
　　 1.誘導分化過程中印記調控區(qū)域的差異性DNA甲基化區(qū)KνDMR1的第18-23個CpG位點甲基化狀態(tài)的改變可能與印記基因Kcnq1、Cdkn1c的印記丟失相關。
　　 2.誘導分化過程中DNA甲基轉移酶水平升高，可能介導了KνDMR1區(qū)甲基化狀