IL-10受體基因多態(tài)性及其信號轉導通路與人SLE發(fā)病關系的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一個可累及全身多個系統(tǒng)的慢性炎癥性自身免疫性疾病。SLE臨床表現(xiàn)各異,可累及皮膚、粘膜、關節(jié)、腎臟、肺、心臟、血液系統(tǒng)等多個系統(tǒng)。SLE病因不清,可能與遺傳、性激素、感染及環(huán)境、機體免疫異常等多種因素有關。目前一般認為SLE的發(fā)病是激素和環(huán)境因素觸發(fā)了具有遺傳易感性的個體發(fā)生了免疫異常,最終導致各個臟器損傷。白細胞介素10

2、(Interlukin-10,IL-10)是Th2類細胞因子,抑制Th1細胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、INF-α,等細胞因子,抑制單核細胞活化及分泌細胞因子,具有免疫抑制作用;然而IL-10還可以促進人B細胞增殖并分化為分泌抗體的細胞,促進CD8+T細胞活化,又具有免疫刺激作用。近年的研究證實IL-10參與調節(jié)性T細胞的分化和功能。Llorente等最早描述了SLE患者外周血單個核細胞(peripheral bloodmononucle

3、ar cells,PBMC)IL-10mRNA表達增高,而健康對照表達較少。后續(xù)的多個研究證實了IL-10mRNA和蛋白在SLE患者PBMCs中表達增高,而且?guī)缀跛袦y定血清IL-10水平的研究均支持IL-10與SLE疾病活動性相關。但是其作用機制還不明確,多數(shù)研究證明IL-10促進SLE發(fā)生發(fā)展,也有的試驗表明IL-10在SLE發(fā)病中具有保護作用。所以我們假設IL-10受體在SLE中可能有異常,導致IL-10作用的不一致性。
　

4、　 IL-10必須與其特異性受體結合才能發(fā)揮作用。功能性的IL-10受體包括四個亞單位,兩個與配體特異性結合的α鏈(Interlukin-10 receptora,IL-10R1)和兩個輔助信號轉導的β鏈(Interlukin-10 receptorβ,IL-10R2)。IL-10與IL-10R1結合后,經(jīng)JAK-STAT信號轉導系統(tǒng)向細胞內傳遞興奮性或抑制性信號。對小鼠IL-10R1基因編碼區(qū)序列進行的DNA序列分析顯示,狼瘡模型小

5、鼠NZW和MRL/1pr小鼠的IL-10R1基因共同存在多處變異,而非狼瘡鼠則無相關變異,提示IL-10R1可能是一個狼瘡易感基因。最近有研究表明,在歐洲白人中IL10R1有意義多態(tài)性位點G330R在SLE患者和類風濕關節(jié)炎患者中分布增高,提示其可能與SLE易感性有關。
　　 關于IL-10R在SLE中表達情況及功能方面的研究較少,2003年Cairns AP等檢測了SLE、類風濕關節(jié)炎患者及正常對照者外周血白細胞表面IL-10

6、R1表達情況,結果未發(fā)現(xiàn)3組之間IL-10R表達有差異。Valencia-Pacheco G等用流式細胞術檢測了19例SLE患者和15例健康對照PBMCs的IL-10R表達情況,結果發(fā)現(xiàn)SLE患者和健康對照IL-10R表達水平相似,IL-10誘導的Jak-1、Tyk-2、Star-1、Stat-3磷酸化水平也沒有明顯差別,但是IL-10R誘導的基因表達有顯著差異,主要是凋亡相關基因和細胞因子及其受體基因。
　　 為了研究IL-1

7、0R1外顯子基因多態(tài)性與中國漢族SLE患者發(fā)病的相關性,我們首先對50例中國北方漢族人群IL-10R1外顯子進行了基因測序,得到了中國漢族人IL-10R1外顯子基因多態(tài)性的分布情況,進而篩選出分布頻率大于0.1的能導致編碼氨基酸改變的有義SNP位點進行了疾病相關性分析。為進一步明確IL-10R在SLE發(fā)病過程中的作用,我們還應用流式細胞術方法檢測了SLE患者及正常對照者外周血細胞的IL-10R1表達情況和IL-10R信號轉導通路有無異常

8、。
　　 試驗方法：
　　 一、病例
　　 在基因相關性分析中,對309例SLE患者和303例正常對照者進行了IL-10R1外顯子基因多態(tài)性檢測。對28例SLE患者和14例正常對照進行了外周血細胞IL-10R1表達檢測,其中14例狼瘡腎炎患者,14例非狼瘡腎炎。共對13例SLE患者和7例正常對照者進行了IL-10R通路的檢測。
　　 SLE的診斷符合1982年美國風濕病協(xié)會(ACR)制定的SLE分類標準,

9、分類標準11項中,如有4項或4項以上診斷為SLE。正常對照者與SLE患者性別、年齡相匹配。以SLE疾病活動性指數(shù)(SLE disease activity index,SLEDAI)判定SLE疾病活動性,計分超過或等于9分為病情活動(Active),否則為非活動性(Inactive)。
　　 二、DNA測序
　　 采用酚氯仿法提取基因組DNA。根據(jù)IL-10R1的7個外顯子分別設計引物,擴增序列包含各外顯子上下游至少50

10、個堿基對。PCR擴增、瓊脂糖電泳后切膠,回收純化,行測序PCR反應及基因測序。
　　 三、IL-10R1表達
　　 于早晨空腹時抽取肘靜脈肝素抗凝血。標記方法如下:100ul全血細胞,分別加入不同的熒光抗體或同種型對照,室溫下避光標記30分鐘(min),然后紅細胞裂解15min,PBS洗細胞兩次,上機檢測。
　　 四、分離外周血單個核細胞,細胞培養(yǎng)
　　 應用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,PBS洗兩

11、次,最后加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞,放入濕潤37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
　　 五、磷酸化染色
　　 調整PBMC濃度為5×105/ml,加入24孔板,在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時,之后加入不同劑量的重組人IL-10或PBS(陰性對照)處理細胞,然后按照流式細胞術磷酸化染色方法進行Stat1、Stat3的磷酸化標記、檢測。
　　 六、細胞增殖分析

12、r>　　 調整PBMC濃度為10×105/ml,加入96孔平底培養(yǎng)板中,培養(yǎng)1小時后加入IL-10或PBS處理細胞,再培養(yǎng)72小時后進行細胞增殖分析。增殖分析采用promage Celltiter96 AQ One solution試劑盒。以IL-10處理后細胞的吸光度與PBS處理后細胞的吸光度的比值表示細胞增值率。
　　 試驗結果：
　　 一、中國漢族人群IL-10R1外顯子多態(tài)性分布情況:
　　 首先,我們

13、對50個樣本IL-10R1全部7個外顯子進行了測序,結果共發(fā)現(xiàn)7個SNP位點,分別為位于外顯子2的G254A(rs4252249),位于外顯子4的A533G(rs2256111)和G599A(rs2228054),位于外顯子5的A744G(rs2228055),位于外顯子6的C810T,位于外顯子7的C1046T(rs2229115)和A1125G(rs2229113)。其中A744G、C810T、A1125G是能夠導致編碼氨基酸序列改

14、變的有義SNP位點。選擇分布頻率大于0.1的有義SNP位點A744G做了進一步的相關性分析。
　　 二、IL-10R1 SNP位點A744G與SLE發(fā)病的相關性分析:
　　 共完成了309例SLE患者和303例正常對照者IL-10R Exon5 DNA測序。結果顯示正常對照組中A744G位點g等位基因分布頻率為24.6％,a等位基因分布頻率為75.4％,SLE患者組中g等位基因分布頻率為25.6％,a等位基因分布頻率為7

15、4.4％。a、g等位基因在SLE患者組和正常對照組中的分布沒有差異,p=0.693。而A744A、A744G、G744G基因型在兩組中的分布頻率也沒有差異,p=0.906,這說明此SNP位點與SLE的發(fā)病沒有相關性。
　　 三、IL-10R1在SLE外周血中的表達情況:
　　 IL-10R1在外周血CD14+單核細胞中表達百分率和平均熒光強度最高,其次為CD8+T細胞,再次為CD4+T細胞,CD19+細胞表達最低。

16、>　　 總的SLE患者組和正常對照組相比,各細胞群內IL-10R1的表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異。但是狼瘡腎炎組(LN,14例)的IL-10R1表達水平低于正常對照組(14例)和非狼瘡腎炎組(14例),其中CD4+細胞群內MFI(12.8±2.9)與正常對照組(15.9±2.4)相比具有明顯差異,p值為0.005。另外,活動性狼瘡患者組的CD4+細胞群內IL-10R1表達水平低于穩(wěn)定期狼瘡患者組,MFI分別為14.0±4.0和17.6±4.

17、7,p值為0.038。
　　 CD4+T細胞和CD8+T細胞的IL-10Rl MFI與SLEDAI評分呈明顯負相關(p值分別為0.007和0.004),即IL-10R1表達水平越高,其疾病活動度越低,反之,IL-10R1表達水平越低,其疾病活動度越高。而CD14+細胞的IL-10R1 MFI與SLEDAI評分無相關性。
　　 四、IL-10刺激后Stat1、Stat3的磷酸化分析:
　　 不加IL-10的PBMC

18、有一部分是處于磷酸化狀態(tài)的。加入IL-10刺激后,Stat1、Stat3磷酸化細胞比例及磷酸化水平均有增高,以磷酸化Stat3的增高水平顯著,10ng/ml刺激15min時陽性細胞比例可達90％以上,而Stat1-P的增高水平較低。說明IL-10刺激后Stat3是主要的轉錄因子。
　　 5ng/ml IL-10即對PBMC的Stat1、Stat3的磷酸化有刺激作用,10ng/ml IL-10刺激作用達到平臺期。IL-10刺激5m

19、in時可見Stat3明顯的磷酸化,正常人在15min時磷酸化水平達到高峰,30min時開始下降,而SLE患者Stat3磷酸化延遲,30min時才達高峰。
　　 IL-10刺激后Stat3磷酸化水平在總SLE組與正常對照組之間沒有差別。而活動性SLE組IL-10刺激后Stat3磷酸化水平,明顯低于正常對照組和非活動性SLE組,p＜0.001,提示活動性SLE的IL-10R-Stat3信號轉導通路有異常改變。Stat1磷酸化水平在各

20、組中均沒有差別。
　　 五、IL-10對PBMC的抑制作用研究:
　　 用5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml IL-10分別刺激分離培養(yǎng)的PBMC,72小時后檢測細胞增殖率。與正常人相比,IL-10對SLE患者PBMC的抑制作用減弱,但是差別無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1、共發(fā)現(xiàn)IL-10R1外顯子7個SNP位點,分布頻率與歐洲白種人不同。分布頻率＞0.1的有義SNP位點