豬苓和蜜環(huán)菌人工培養(yǎng)及影響幾種有效成分產(chǎn)生因素的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文系統(tǒng)地研究了豬苓、伴生菌和蜜環(huán)菌的固體培養(yǎng)特性和液體培養(yǎng)條件,以及影響豬苓菌核和蜜環(huán)菌子實(shí)體發(fā)生的因素,并對影響豬苓酮類成分、多糖和黑色素產(chǎn)生的因素進(jìn)行了研究。 豬苓菌的營養(yǎng)需求比較簡單,在只有碳源和氮源的簡單培養(yǎng)基上就能夠生長。麥芽汁培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基和GPC培養(yǎng)基比較適合于豬苓菌固體培養(yǎng)。除了尿素,豬苓對碳源和有機(jī)氮源的適應(yīng)性很強(qiáng),但在不同的碳源條件下,其菌絲生長速度和氣生菌絲形態(tài)會有較大差別。玉米漿、酵母膏、奶粉、硫

2、胺素、伴生菌提取物、蜜環(huán)菌提取物、活性白土、硅藻土、高嶺土都對豬苓固體培養(yǎng)的生長顯示出不同程度的促進(jìn)作用。豬苓的適宜生長溫度是25℃。 進(jìn)行了3m3發(fā)酵罐的豬苓菌絲體液體培養(yǎng)的中試生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)。適合作為三角瓶種子制作的液體培養(yǎng)基為玉米面液體培養(yǎng)基(用于搖床培養(yǎng))或麥芽汁液體培養(yǎng)基(靜止培養(yǎng))。在0.5m3的一級種子罐中投料0.3m3,接種量1%,溫度25℃,通氣量1∶0.5,培養(yǎng)至190hr(菌絲干重達(dá)到0.23%)適合轉(zhuǎn)接二級罐。

3、二級3m3發(fā)酵罐投料體積為2m3,接種量15%,溫度25℃,通氣量1∶0.5,間歇攪拌,攪拌轉(zhuǎn)速120rpm,培養(yǎng)115h放罐,菌絲干重達(dá)到1%以上。適合作為判斷放罐標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)是菌絲體的染色形態(tài)和發(fā)酵液中的氨基氮含量,菌絲干重、發(fā)酵液糖含量以及pH可以作為輔助判斷指標(biāo)。豬苓菌絲液體培養(yǎng)時(shí)菌絲結(jié)成致密的小球狀。菌絲濾餅呈乳白色,新鮮的發(fā)酵液和菌絲體都有濃郁的苦杏仁味。和真空干燥相比,氣流干燥方式更適合于豬苓菌絲體的干燥。 豬苓菌液

4、體搖瓶培養(yǎng)的生長周期為:延遲期為第0~8天,對數(shù)生長期為第9~13天,穩(wěn)定期為第14~18天,第18天之后開始衰亡期。三個(gè)生長期的菌絲體的甲醇提取物的HPLC-DAD圖譜有差異,其中的檢測到的豬苓酮類成分的種類和數(shù)量也有較大差異,對數(shù)期菌絲體的豬苓酮類成分種類最少,檢測到3個(gè)成分,穩(wěn)定期菌絲體和衰亡期菌絲體中都能檢測到6個(gè)成分。穩(wěn)定期菌絲體多糖含量最高,比對數(shù)期和衰亡期菌絲體高出55%以上。用紙層析法初步測定豬苓菌絲體和發(fā)酵液多糖的單糖

5、組成是葡萄糖,與菌核提取的多糖單糖組成一致。 豬苓在麥芽汁培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生菌核。以甘油或甘露醇作為培養(yǎng)基碳源時(shí),能夠誘導(dǎo)豬苓菌核產(chǎn)生,而且與甘油或甘露醇的濃度有關(guān)。而在GPC培養(yǎng)基中添加玉米漿、酵母膏、奶粉、硫胺素、伴生菌提取物、蜜環(huán)菌提取物、活性白土、硅藻土或高嶺土沒有誘導(dǎo)出豬苓菌核。菌核在18~25℃下都能形成,這個(gè)溫度范圍也適合于菌絲生長。在鋸末為主要培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)基中添加甘油或甘露醇,能夠誘導(dǎo)豬苓菌核的形成。人工培養(yǎng)的菌

6、核和天然菌核一樣,都含有豬苓酮A和豬苓酮B,人工培養(yǎng)的菌核中檢測到的豬苓酮類成分的種類(10種)多于天然菌核(8種)。 研究了蜜環(huán)菌子實(shí)體的發(fā)生條件,內(nèi)容包括子實(shí)體發(fā)生與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基量、培養(yǎng)時(shí)間等的關(guān)系。麥芽汁培養(yǎng)基是適合蜜環(huán)菌子實(shí)體發(fā)生的培養(yǎng)基,在該培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌子實(shí)體發(fā)生率可以達(dá)到100%,子實(shí)體最短可以在45天發(fā)生。子實(shí)體發(fā)生與培養(yǎng)基瓶裝量有關(guān),每瓶中培養(yǎng)基總固形物(瓊脂除外)達(dá)到6.75g才足以發(fā)生子實(shí)體。子實(shí)體發(fā)

7、生時(shí)間與25℃的培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)系,培養(yǎng)時(shí)間不足使子實(shí)體發(fā)生時(shí)間延遲。菌體總生物量對培養(yǎng)基中總營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到65.90%,子實(shí)體生物量對培養(yǎng)基中總營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化率為1.52%~9.11%。 采用麥芽汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)蜜環(huán)菌獲得蜜環(huán)菌菌絲體,采用麥芽汁半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蜜環(huán)菌獲得蜜環(huán)菌菌索、皮殼狀菌絲以及子實(shí)體。以高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)比較了四種菌體的甲醇提取物的成分差異。在蜜環(huán)菌素類成分上,液體培養(yǎng)

8、的蜜環(huán)菌菌絲體與固體培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌索、皮殼狀菌絲、子實(shí)體有明顯差別,液體培養(yǎng)的蜜環(huán)菌菌絲體中檢測到5種蜜環(huán)菌素類成分,固體培養(yǎng)的菌體中沒有檢測到。圖譜分析表明,菌索與皮殼狀菌絲的成分接近,而菌索與子實(shí)體、菌索與液體培養(yǎng)的菌絲體之間都有較大差別。在比較的四種蜜環(huán)菌特化菌體中,菌索與皮殼狀菌絲成分接近,而另外兩種菌絲成分差異較大。 NaOH和甲醛可以誘導(dǎo)蜜環(huán)菌菌索產(chǎn)生黑色素。用野生蜜環(huán)菌菌索提取黑色素,提取率為2.74%,其紅外光譜

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