LDHA在肝癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球常見第六位腫瘤，并位于腫瘤死因的第三位。我國是原發(fā)性肝癌發(fā)病率較高的國家，每年新發(fā)肝癌的病例數(shù)占世界發(fā)病數(shù)的54％，位于腫瘤死因的第二位。雖然以手術(shù)為主的新型治療手段出現(xiàn)，使得肝癌生存率有了較大的提高，但是超過60％的患者在術(shù)后5年有復(fù)發(fā)可能，較高的復(fù)發(fā)率成為提高患者總體生存的主要障礙。隨著人類基因組學(xué)研究的發(fā)展和基因芯片與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的產(chǎn)生，高通量基因和蛋白質(zhì)分

2、析成為了可能，對(duì)不同肝癌患者的分子特征的認(rèn)識(shí)逐漸深入，基于分子分型基礎(chǔ)之上的臨床病理分子分型和分期系統(tǒng)可使肝癌患者細(xì)分為眾多的亞群，在這一基礎(chǔ)之上傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療、免疫治療、生物治療和新的分子靶向治療等均可按照肝癌患者的個(gè)體化特征采用完全個(gè)體化的高效的精準(zhǔn)治療手段，分子分型可給靶向治療提供更多的靶點(diǎn)。因此，尋找肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物，開展肝癌的新型分子靶向治療，以期達(dá)到較高的療效，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　惡性腫瘤內(nèi)出現(xiàn)的嚴(yán)

3、重的急慢性缺氧，葡萄糖的攝取和無氧糖酵解增加，造成腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移和對(duì)放化療等治療抵抗，使目前的治療方法難以達(dá)到理想的效果，為腫瘤的治療帶來了難題，同時(shí)也帶來探索腫瘤治療的切入點(diǎn)。靶向細(xì)胞的生化代謝中的糖酵解途徑已逐漸成為癌癥診斷及治療的關(guān)鍵，結(jié)合FDG-PET分子顯像為腫瘤的早期診斷與鑒別診斷、腫瘤內(nèi)缺氧程度的評(píng)價(jià)、治療前后效果的評(píng)估和預(yù)后的判斷開辟新的前景。
　　乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase，

4、LDH)廣泛存在于人體的各個(gè)組織中，主要催化糖酵解途徑的終產(chǎn)物丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化。乳酸脫氫酶按照組成亞基(M型、H型)的差異分為5種同工酶。乳酸脫氫酶-A(LactateDehydrogenase-A，LDHA)屬于乳酸脫氫酶家族同工酶之一，全部由M型亞基組成，正常情況下主要分布在肌肉組織中。LDHA主要功能是催化丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化，同時(shí)將NADH轉(zhuǎn)化成NAD+。LDHA基因的突變?cè)谌梭w除可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)型肌紅蛋白尿之外，對(duì)人體影響不大

5、。近年來研究發(fā)現(xiàn)LDHA在各種實(shí)體腫瘤組織中異常表達(dá)，且和腫瘤的分化及患者的預(yù)后具有重要的關(guān)系，可能是一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。然而，LDHA對(duì)肝癌生長的影響，特別是對(duì)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響至今仍不十分清楚。本論文研究不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系及人肝癌組織中LDHA表達(dá)情況，分析LDHA表達(dá)與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系;采用慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)，研究靶向LDHA基因的治療策略在體內(nèi)外對(duì)肝癌細(xì)胞生長及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，為LDHA作為靶點(diǎn)的肝

6、癌基因治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);利用基因表達(dá)譜差異芯片篩選LDHA抑制前后差異表達(dá)基因和信號(hào)通路，揭示LDHA影響肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。
　　第一部分:LDHA在肝癌細(xì)胞系及肝癌組織中的表達(dá)
　　研究不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系及人肝癌組織中LDHA表達(dá)情況，分析LDHA表達(dá)與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。分別應(yīng)用Real-timePCR，WesternBlot和生化速率法檢測正常肝細(xì)胞系L-02和5種不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系H

7、ep3B、HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3細(xì)胞LDHA的表達(dá)和乳酸脫氫酶活性水平;收集62例原發(fā)性肝癌組織芯片，其中47例無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，15例有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，用免疫組織化學(xué)方法檢測LDHA表達(dá)情況。Real-timePCR結(jié)果表明，在mRNA水平具有相同遺傳背景的不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系隨侵襲轉(zhuǎn)移潛能增高，LDHA的表達(dá)也依次增高，HCCLM3細(xì)胞LDHAmRNA表達(dá)水平最高，WesternBlot的結(jié)果與Real-

8、timePCR結(jié)果一致。轉(zhuǎn)移潛能高的細(xì)胞系細(xì)胞胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性均顯著高于轉(zhuǎn)移潛能較低的細(xì)胞系。免疫組化結(jié)果顯示:在肝癌組織中LDHA為胞漿內(nèi)表達(dá)，部分有核內(nèi)表達(dá)，62例肝癌組織中LDHA表達(dá)均為陽性，定量分析結(jié)果表明LDHA的表達(dá)水平在有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組顯著強(qiáng)于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組。以上結(jié)果表明:LDHA在肝癌細(xì)胞株和人類原發(fā)性肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，且與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)，LDHA基因高表達(dá)可作為判斷HCC侵襲性和進(jìn)展的一個(gè)

9、重要指標(biāo)。
　　第二部分:LDHA基因RNAi體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　為進(jìn)一步研究LDHA對(duì)肝癌細(xì)胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，通過靶向LDHA基因的RNA干擾技術(shù)抑制LDHA表達(dá)，觀察高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系HCCLM3生長、侵襲能力以及裸鼠移植瘤腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的改變，探索靶向LDHARNAi對(duì)肝癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用。首先設(shè)計(jì)、合成LDHAsiRNA，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞，Real-timePCR和Weste

10、rnBlot檢測干擾效果。篩選出干擾效率較高靶點(diǎn)用于合成shRNA，構(gòu)建LDHAshRNALenti.干擾質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞，Real-timePCR，WesternBlot和生化LDH酶活性檢測驗(yàn)證干擾效果，篩選出干擾效率較高的shRNA重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。應(yīng)用CCK8、體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖和侵襲能力的改變。裸鼠原位移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察LDHA干擾病毒對(duì)肝癌生長、轉(zhuǎn)移和裸鼠生存期的影響。結(jié)果表明:針對(duì)LD

11、HA基因的LDHAsiRNALenti.重組病毒轉(zhuǎn)染HCCLM3細(xì)胞48h后，Real-timePCR和WesternBlot結(jié)果顯示LDHA基因表達(dá)水平下降92.8％，蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降66.8％。在0.4μg/mLpuromycin選擇性培養(yǎng)3周后，得到LDHA低表達(dá)的穩(wěn)定克隆細(xì)胞株，經(jīng)驗(yàn)證LDHAmRNA抑制率大于73.3％，蛋白質(zhì)水平和LDH酶活性水平分別下降56.2％和63.2％。體外增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了LDHAshRNA

12、Lenti.后，HCCLM3細(xì)胞增殖能力明顯降低，細(xì)胞倍增時(shí)間由原來的39.52h增至54.39h，延長了17.8h。侵襲能力明顯降低，與PBS組和對(duì)照重組病毒組（ControlshRNALenti.）相比兩者差異有顯著性。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，LDHAshRNALenti.組腫瘤瘤體重(1.43g±0.20g)低于ControlshRNALenti.組(2.19g±0.37g，P＜0.01)和PBS組(2.34g±0.55g，P＜0.01)。

13、ControlshRNALenti.組和PBS組裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移率分別為71.4％和75％，而LDHAshRNALenti.組只有1只(1/10，10％)裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肝癌的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著下降。LDHAshRNALenti.組荷瘤裸鼠的生存期為141.2d±6.80d，與ControlshRNALenti.組(91.83d±12.87d)和PBS組(95.6d±5.81d)相比差異顯著(P＜0.01)。以上結(jié)果表明:LDHA基因下調(diào)后

14、肝癌細(xì)胞侵襲潛能下降，裸鼠肝癌移植瘤生長被抑制，肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移能力降低，故認(rèn)為LDHA是治療原發(fā)性肝癌的潛在靶標(biāo)。靶向肝癌細(xì)胞LDHA基因RNA干擾技術(shù)，對(duì)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移抑制作用研究尚未見其他文獻(xiàn)報(bào)道。
　　第三部分:LDHA參與肝癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究
　　為揭示針對(duì)上D尼4基因靶向治療的抗腫瘤作用機(jī)制，我們首先應(yīng)用nlumina基因芯片對(duì)分別轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.和ControlshRNALenti.的H

15、CCLM3細(xì)胞進(jìn)行全基因組掃描尋找差異表達(dá)基因，應(yīng)用GO對(duì)基因進(jìn)行功能聚類分析。根據(jù)差異基因芯片分析提供的線索，我們分別從葡萄糖代謝，凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移三個(gè)方面揭示LDHA參與肝癌生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本研究中，我們共發(fā)現(xiàn)3268個(gè)差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)差異表達(dá)基因1663個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因1605個(gè)。通過GO數(shù)據(jù)庫對(duì)基因功能注釋并進(jìn)行基因功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)基因主要參與:能量代謝，黏附與受體相關(guān)生物學(xué)過程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

16、，炎癥反應(yīng)，酶相關(guān)生物學(xué)過程，金屬離子結(jié)合，膠原與纖維蛋白相關(guān)生物學(xué)過程，細(xì)胞凋亡，血管發(fā)生，細(xì)胞增殖分化和發(fā)育，皮膚發(fā)育，免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。
　　根據(jù)差異基因芯片分析提供的線索，我們?cè)隗w外細(xì)胞學(xué)水平，對(duì)LDHA影響糖酵解，凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移三個(gè)方面作了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.細(xì)胞葡萄糖消耗率下降，乳酸生成增加，氧消耗增加，ATP產(chǎn)生下降，提示下調(diào)LDHA可抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解水平，細(xì)胞增殖能力

17、下降，腫瘤細(xì)胞可能轉(zhuǎn)向耗氧更多的能量代謝途徑，比如氧化磷酸化等，以滿足自身生長代謝的需要;轉(zhuǎn)染LDHAshRNALenti.細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能是氧化磷酸化水平增高，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，NAC可以清除因LDHA抑制引起的ROS產(chǎn)生增加，也可抑制ROS引起的凋亡增加。抑制LDHA表達(dá)致HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞線粒體膜電位下降，胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加。Ca2+作為主要的細(xì)胞內(nèi)信使，參與調(diào)控許多細(xì)胞和組織的生理活動(dòng)，Ca2+釋放，刺激PTP

18、敏感性增加，促進(jìn)PTP的開放，PTP的開放可增加線粒體外膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素-c釋放，活化Caspases-9，引發(fā)死亡蛋白酶Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;抑制LDHA基因表達(dá)可上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)FAK表達(dá)，二者呈現(xiàn)的最終的生物學(xué)作用均為抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和侵襲發(fā)能力。與ControlshRNALenti.組和PBS組相比，LDHAshRNALenti.組VEGF、MMP-2表達(dá)下降，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移發(fā)生。綜

19、合以上結(jié)果，我們得出這樣的推論:LDHA作為肝癌基因治療新的靶點(diǎn)，其抗腫瘤的機(jī)制，除了能抑制腫瘤優(yōu)勢獲能途徑—糖酵解，減少能量供給外，還可促解氧化磷酸化過程，而氧化磷酸化增強(qiáng)引起了ROS產(chǎn)生等一系列氧化應(yīng)激過程，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生。同時(shí)，LDHA具有癌基因的某些功能，調(diào)控著E-cadherin、FAK、VEGF和MMP-2等與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)，下調(diào)肝癌細(xì)胞LDHA基因可以抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：<

20、br>　　1.LDHA在肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中高表達(dá)，LDHA表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)。
　　2.RNA干擾下調(diào)LDHA表達(dá)后，肝癌細(xì)胞HCCLM3增殖侵襲能力下降，并引起裸鼠移植瘤腫瘤生長抑制，肝內(nèi)和肺內(nèi)轉(zhuǎn)移率下降，生存期延長，故認(rèn)為LDHA是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)。
　　3.LDHA基因與糖代謝過程、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等信號(hào)通路有關(guān)。抑制LDHA表達(dá)，可抑制糖酵解過程，減少ATP產(chǎn)生，細(xì)

21、胞增殖能力下降;致腫瘤細(xì)胞ROS產(chǎn)生、Ca2+內(nèi)流增加，影響線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素-c釋放，活化Caspases-9，引發(fā)死亡蛋白酶Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;抑制LDHA表達(dá)，可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)FAK、VEGF和MMP-2表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和侵襲能力。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)LDHA參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程，為預(yù)測和治療原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)提供了新靶標(biāo)。
　　2.初步探索靶向LD

22、HA的RNA干擾對(duì)肝癌細(xì)胞體外生長和侵襲的影響及抑制體內(nèi)成瘤、轉(zhuǎn)移的治療效果。
　　3.揭示了針對(duì)LDHA基因靶向治療的抗腫瘤作用機(jī)制，證實(shí)LDHA基因與糖酵解過程、凋亡途徑和侵襲轉(zhuǎn)移等信號(hào)通路有關(guān)。抑制LDHA表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制或促進(jìn)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值：
　　1.LDHA是抑制肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。
　　2.為針對(duì)LDHA基因靶向治療的抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)