天然抗體3B4的抗金黃色葡萄球菌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、天然抗體(natural antibodies, Nabs)是指在沒有任何抗原免疫的情況下，正常機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)一種或多種自身或外源抗原的抗體，主要為IgM同種型，由未突變的胚系基因編碼，具有維持自身穩(wěn)定、抗感染、參與移植排斥、腫瘤監(jiān)視等作用。 抗感染是天然抗體的重要功能，天然抗體與補(bǔ)體、單核-巨噬細(xì)胞等一起構(gòu)成了機(jī)體抵御感染的第一道防線。通過多反應(yīng)性，天然抗體可以和多種病原體結(jié)合。天然抗體主要結(jié)合微生物表面保守的結(jié)構(gòu)，通過與To

2、ll樣受體等PRR相似的方式發(fā)揮對(duì)病原體的識(shí)別，并在細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等的感染中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。 B1細(xì)胞是產(chǎn)生天然抗體的主要細(xì)胞。目前研究認(rèn)為成熟B細(xì)胞分為B1細(xì)胞、濾泡B細(xì)胞和邊緣區(qū)B細(xì)胞三個(gè)亞群，其中B1細(xì)胞是近10余年來發(fā)現(xiàn)并命名的B細(xì)胞亞群，主要位于腹腔和胸膜腔，在天然免疫、自身免疫和粘膜免疫中具有重要的作用。以往研究發(fā)現(xiàn)B1細(xì)胞缺陷的小鼠對(duì)細(xì)菌等病原微生物高度易感，然而，關(guān)于天然抗體和B1細(xì)胞在病原體感染時(shí)

3、的效應(yīng)機(jī)制尚不明確。 以往主要應(yīng)用混合的血清天然抗體、分泌型IgM缺陷的小鼠和CD19轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及B1細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行天然抗體及B1細(xì)胞在抗感染中作用的研究，取得了很多重要的結(jié)論。然而，由于沒有純化的特異性天然抗體及高天然抗體滴度轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使得關(guān)于天然抗體和B1細(xì)胞的作用機(jī)制的研究一直受到制約。 近年來，隨著耐藥金黃色葡萄球菌的不斷出現(xiàn)以及免疫受損人群增多，耐藥金黃色葡萄球菌引起的感染越來越受到人們重視，成為

4、醫(yī)院感染的重要死亡原因之一。天然免疫特別是天然抗體在抗金黃色葡萄球菌感染中的作用引起了越來越多學(xué)者的興趣。 本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，來自未免疫小鼠B細(xì)胞的天然抗角蛋白自身抗體3B4可以識(shí)別金黃色葡萄球菌，并可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬，從而提示天然抗體3B4在抵御金黃色葡萄球菌感染中可能具有的重要作用。結(jié)合天然抗體3B4轉(zhuǎn)基因小鼠，我們對(duì)天然抗體的抗細(xì)菌感染作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并利用這一小鼠模型對(duì)B1細(xì)胞的應(yīng)答進(jìn)行了深入探索。

5、 一．天然抗體3B4的體外抗金黃色葡萄球菌作用 采用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3B4對(duì)金黃色葡萄球菌的結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然抗體3B4可以結(jié)合于金黃色葡萄球菌表面的抗原。 天然抗體3B4及對(duì)照抗體（MOPC）與金黃色葡萄球菌作用后，分別與小鼠腹腔細(xì)胞共孵育，結(jié)果菌落形成實(shí)驗(yàn)顯示3B4作用組菌落形成單位少于對(duì)照組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到3B4作用組的吞噬指數(shù)顯著高于同型對(duì)照，表明天然抗體可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬。

6、 二．利用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行抗金黃色葡萄球菌感染的在體研究 金黃色葡萄球菌腹腔接種后觀察小鼠菌負(fù)荷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子濃度等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔、腎臟細(xì)菌負(fù)荷顯著低于對(duì)照小鼠；轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔中性粒細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照小鼠，炎癥因子IL-12 、IFN-γ濃度與對(duì)照鼠相比無明顯差異，而IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α濃度顯著低于陰性對(duì)照小鼠。表明轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)于金黃色葡萄球菌腹腔感染具有良好的抵抗。

7、 三．天然抗體3B4及B1細(xì)胞的作用機(jī)制研究 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著高于陰性對(duì)照小鼠。ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠，陰性對(duì)照小鼠腹腔沖洗液總IgM、抗角蛋白IgM、抗金黃色葡萄球菌IgM水平。 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠與陰性小鼠的總IgM水平無顯著差異，但轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔抗角蛋白IgM水平顯著高于對(duì)照小鼠，并且轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔沖洗液中抗金黃色葡萄球菌的IgM濃度顯著高于對(duì)照小鼠。與腹腔抗角蛋白/金黃

8、色葡萄球菌滴度相一致，感染后轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔漿細(xì)胞數(shù)顯著增多，提示細(xì)菌刺激后導(dǎo)致B細(xì)胞活化并轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞。進(jìn)一步檢測(cè)了B1細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的B1a細(xì)胞增殖顯著強(qiáng)于對(duì)照小鼠，提示基于對(duì)病原體的識(shí)別，轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔B1細(xì)胞發(fā)生了顯著的活化和增殖，分泌大量的抗體，在抗細(xì)菌感染中發(fā)揮了重要的作用。 同時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)的B1細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的結(jié)合/吞噬明顯增加，為了區(qū)別是結(jié)合還是吞噬，進(jìn)一步應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行了觀察，發(fā)