TIM4對(duì)小鼠食物過敏模型中抗原特異性Th2細(xì)胞人化的影響.pdf

1、隨著新型抗生素和疫苗的發(fā)展及其在臨床上的應(yīng)用，感染性疾病的治療已取得巨大成功，但在過去的幾十年，過敏性疾病卻呈現(xiàn)出明顯上升趨勢(shì)，大約15％-20％的人對(duì)外源抗原產(chǎn)生1gE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，其中約有2％-6％的人存在食物過敏(food allergy, FA)及相關(guān)癥狀。近年雖然過敏性疾病成為研究熱點(diǎn)且已有較多的研究，但是過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制及病因?qū)W仍不清楚，其治療方法有限且效果不佳。
　　 研究顯示樹突狀細(xì)胞(dendritic

2、cell，DC)和Th2細(xì)胞在過敏免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。DC是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC),也是唯一能激活初始T細(xì)胞的APC，DC捕獲和加工外源性抗原，并遞呈抗原信息給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。成熟的DC高表達(dá)MHC-Ⅰ／Ⅱ類分子、共刺激分子如CD80和CD86等協(xié)助抗原信息的遞呈，有效活化T細(xì)胞。初始CD4+T細(xì)胞被激活后分化為Th1、Th2、Th17或Treg細(xì)胞，

3、Th2細(xì)胞主要釋放細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13。這些細(xì)胞因子不僅在誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性IgE中起重要作用，而且在粘液分泌、肌肉收縮、和嗜酸性粒細(xì)胞增多中起重要作用。當(dāng)再次暴露于特異性抗原后，IgE交叉連接激活肥大細(xì)胞釋放過敏性介質(zhì)，促發(fā)過敏性反應(yīng)和產(chǎn)生過敏性臨床癥狀。因此Th2細(xì)胞的極化是食物過敏免疫機(jī)制中重要一步。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白(T cell immunoglobulin and muci

4、n domains，TIMs)基因家族是一組新的細(xì)胞表面蛋白家族。已發(fā)現(xiàn)TIMs基因家族在小鼠中包括8個(gè)成員(TIMs1-8)和在人類中3個(gè)成員(TIM1，3和4)。研究顯示TIMs在過敏性疾病和自身免疫性疾病中起重要的調(diào)節(jié)作用。其中TIM4表達(dá)于APC，尤其是成熟的DC，TIM1表達(dá)于T細(xì)胞，特別是Th2細(xì)胞，近來發(fā)現(xiàn)它們是T細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)因子。體外研究顯示DC中TIM4蛋白的表達(dá)與自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)，TIM4結(jié)合TIM1

5、共同促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，且提示TIM4可能作為一個(gè)新的分子來調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)。我們前期研究，顯示在過敏小鼠中存在Treg細(xì)胞功能不全，TIM4與TIM1的相互作用可降低Treg細(xì)胞的功能及狀態(tài)，破壞免疫耐受平衡。但是TIM4對(duì)食物抗原特異性Th2細(xì)胞分化的影響研究甚少，體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)不多，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　 我們推測(cè)微生物產(chǎn)物和食物抗原共同作用能夠?qū)е翭A，其中TIM4與其受體的相互作用可能導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡和免疫耐

6、受的打破，是引起FA的關(guān)鍵。本研究將通過體外培養(yǎng)BMDC，與CD4+T細(xì)胞共同培養(yǎng)來研究微生物產(chǎn)物和食物抗原對(duì)CD4+T細(xì)胞的影響，并應(yīng)用TIM4抗體干預(yù)，探討TIM4在FA發(fā)病過程中的作用，從而進(jìn)一步了解食物過敏發(fā)生的分子機(jī)制，并為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 通過檢測(cè)TIM4 mRNA的表達(dá)，DC表面分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表達(dá)，研究微生物產(chǎn)物對(duì)TIM4的作用和微生物產(chǎn)物對(duì)DC的刺激作用。

7、使用SEB和OVA共同作用于BALB/c小鼠，分離過敏小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，和DC在不同條件下共同培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中Th1/Th2細(xì)胞因子的水平。探討在微生物產(chǎn)物參與的食物過敏( food allergy, FA)中TIM4對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的影響。
　　 方法:
　　 培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived DC，BMDC)，培養(yǎng)的DC分為兩組：金黃色葡萄球菌腸毒素B(

8、SEB)刺激組和空白對(duì)照組。使用SEB和OVA致敏BALB/c小鼠，取過敏模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，和DC細(xì)胞共同培養(yǎng)分為5組：空白對(duì)照組、SEB+卵清蛋白(OVA)共同作用組、SEB組、OVA組及TIM4抗體干預(yù)組。進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　 1．RT-PCR檢測(cè)DC的TIM4mRNA表達(dá)。
　　 2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表達(dá)。
　　 3．ELISA法測(cè)定混合培養(yǎng)細(xì)胞上清液

9、IL-4與IFN-γ的表達(dá)。
　　 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。組間均值比較采用單因素方差分析，以α=0.05為假設(shè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1．體外分離骨髓細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為樹突狀細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)特征性標(biāo)志CD11c純度可達(dá)70％，并具有特征性形態(tài)。
　　 2．使用SEB刺激DC，與空白對(duì)照組相比，SEB刺激組DC TIM4 mRNA表達(dá)明顯增高（0.941±0.018

10、 vs0.422±0.083，均P＜0.05），并具有劑量依從性。
　　 3．使用SEB刺激DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)：SEB刺激組DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(MHC-Ⅱ:76.684％±3.1803％vs52.984％±3.6026％,P=0.000;CD86:89.746％±2.113％vs67.558％±0.4341％,P=0.000)。
　　 4．DC和CD4+T細(xì)胞共同培養(yǎng)中，相比對(duì)照組，

11、SEB+OVA組IL-4表達(dá)顯著增高(295.834±20.408vs78.335±13.109，均P＜0.05)，而IFN-γ的表達(dá)明顯減少（362.109±92.271vs761.897±102.967，均P＜0.05）；SEB組或OVA組IL-4和IFN-γ與空白對(duì)照組無明顯差異：DC和CD4+T細(xì)胞共同培養(yǎng)中應(yīng)用TIM4抗體干預(yù)后，結(jié)果顯示對(duì)比SEB+OVA組IL-4明顯降低，而IFN-γ的表達(dá)明顯增高(P均＜0.05)，與對(duì)照

12、組、SEB組和OVA組相比兩種細(xì)胞因子的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1．SEB刺激DC增加TIM4的表達(dá)。
　　 2．SEB刺激DC促進(jìn)DC上MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)DC功能成熟。
　　 3．SEB和OVA共同刺激促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，共同導(dǎo)致食物過敏。單一的SEB或者OVA不能引起食物過敏反應(yīng)。
　　 4．TIM4抗體干預(yù)抑制Th2細(xì)胞分化，有效糾正