半抗原誘導(dǎo)食物過敏發(fā)生機(jī)制及肥大細(xì)胞對(duì)Th2型過敏反應(yīng)的調(diào)控作用.pdf

1、隨著社會(huì)工業(yè)化、環(huán)境的污染，化學(xué)物質(zhì)，特別是半抗原通過皮膚，呼吸道，消化道等途徑暴露機(jī)會(huì)的增多，過敏性疾病也呈明顯上升趨勢(shì)，食物過敏和相關(guān)疾病在全球范圍內(nèi)迅速增加，大約4％-8％的兒童和1％-2％的成年人對(duì)食物抗原具有IgE介導(dǎo)的高反應(yīng)性。食物過敏(foodallergy)的癥狀輕則表現(xiàn)為輕度不適，重則表現(xiàn)為威脅生命的過敏性休克，已經(jīng)成為了對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)巨大影響的疾病。最近幾年有關(guān)食物過敏領(lǐng)域的研究進(jìn)展迅速，但其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

2、　　 半抗原(Hapten)是小分子量化學(xué)物質(zhì)(＜500Da)，自身不能引起免疫反應(yīng)，但易于和蛋白或肽結(jié)合并影響或改變蛋白的免疫原性，從而引起機(jī)體對(duì)該種蛋白的致敏。研究顯示，半抗原引起的致敏占過敏性疾病發(fā)病的2％-15％左右，“半抗原-特應(yīng)性過敏假說”（Hapten-AtopyHypothesis）提出通過消化道或皮膚接觸化學(xué)物質(zhì)，特別是半抗原暴露的增加，在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，并導(dǎo)致了過敏性疾病的明顯增加。然而，目

3、前為止，有關(guān)半抗原暴露導(dǎo)致的過敏性疾病其具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。近年來，隨著食物過敏的增加，通過食物加工、配方奶粉、抗生素和其他藥物等口服途徑接觸的半抗原成分也明顯增加。半抗原通過口服途徑暴露并與食物蛋白相結(jié)合是否能夠改變食物抗原的免疫原性，并成為食物過敏性疾病增加的環(huán)境誘導(dǎo)因素仍有待進(jìn)一步研究。
　　 T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白(TIM)-1表達(dá)于活化的輔助性T細(xì)胞，TIM4是TIM1的配體，活化的樹突狀細(xì)胞(dendr

4、iticcell，DC)表達(dá)TIM4。研究表明，TIM1與TIM4之間的相互作用在啟動(dòng)抗原特異性的Th2反應(yīng)方面起重要作用，例如當(dāng)暴露于微生物產(chǎn)物葡萄球菌腸毒素(SEB)時(shí)能夠誘導(dǎo)DC表達(dá)TIM4。DC能夠被三硝基苯磺酸(TNBS)活化，然而，是否經(jīng)TNBS活化的DC也能夠表達(dá)TIM4仍不清楚。
　　 食物過敏是以腸道口服耐受受損和Th2(T-helper)極化為特征的免疫反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生食物過敏原特異性IgE抗體。Th2細(xì)胞分泌

5、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能夠有效的激活B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE與肥大細(xì)胞結(jié)合，并導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒釋放絲氨酸蛋白酶、組胺、細(xì)胞因子等介質(zhì)，啟動(dòng)針對(duì)特異性抗原的過敏反應(yīng)。研究顯示，肥大細(xì)胞不僅是過敏反應(yīng)中一種關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，而且能夠調(diào)控很多其它組織功能并參與調(diào)控固有免疫和特異性免疫及外周耐受的形成。肥大細(xì)胞已經(jīng)被看做像淋巴細(xì)胞和其它重要免疫細(xì)胞一樣，在機(jī)體防御及穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。絲氨酸蛋白酶是肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)的一

6、種，研究顯示其具有很強(qiáng)的免疫調(diào)控功能。另外，一次接觸抗原后誘發(fā)的速發(fā)型免疫炎癥反應(yīng)往往能夠自我平息，這種在急性過敏反應(yīng)中起到自我限制和調(diào)控的具體因素仍未闡明。
　　 既然肥大細(xì)胞具有免疫調(diào)控功能，除了引起過敏炎癥反應(yīng)，肥大細(xì)胞可能也在速發(fā)型過敏反應(yīng)的調(diào)控和自限過程中發(fā)揮作用。絲氨酸蛋白酶能夠通過結(jié)合蛋白酶活化受體(protease-activatedreceptors，PAR)-1和PAR-2，從而進(jìn)一步調(diào)控靶細(xì)胞。炎癥反應(yīng)時(shí)，

7、肥大細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，如Th2細(xì)胞，在炎癥局部聚集，從而有機(jī)會(huì)發(fā)生相互作用。研究顯示，Th2細(xì)胞表達(dá)PAR-2和Bcl-6，是否肥大細(xì)胞來源的絲氨酸蛋白酶能夠通過激活PAR-2來調(diào)控Th2中Bcl-6的表達(dá)仍不清楚。人類B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein,Bcl-6)由Bcl-6基因編碼，它是一種進(jìn)化相對(duì)保守的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，又被稱作Bcl-6轉(zhuǎn)錄阻遏因子，近來研究表明，Bcl-6在一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中具

8、有重要的免疫調(diào)控功能，且能夠干擾IL-4基因的轉(zhuǎn)錄過程。來源于Th1和Th2細(xì)胞的不同細(xì)胞因子其表達(dá)量受基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而Bcl-6將可能是影響Th2反應(yīng)中的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。
　　 為維持免疫穩(wěn)態(tài)，機(jī)體存在一種調(diào)控和限制免疫反應(yīng)的機(jī)制，除了活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）機(jī)制外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控方面也具有重要作用。Tregs功能失常將導(dǎo)致過敏性疾病的發(fā)生，導(dǎo)致口服耐受受損和以Th2細(xì)胞為主

9、的過敏反應(yīng)。IL-4和IL-13是Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，在過敏性疾病，如過敏性哮喘、接觸性皮炎和食物過敏發(fā)生時(shí)，Th2型細(xì)胞因子會(huì)明顯增加。研究顯示，Tregs能夠調(diào)控Th2型免疫反應(yīng)以免產(chǎn)生自身組織的損傷。然而，目前，啟動(dòng)針對(duì)Th2型免疫反應(yīng)調(diào)控的起始因素仍有待進(jìn)一步研究。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分為兩種，自然狀態(tài)Tregs和可誘導(dǎo)Tregs，自然狀態(tài)Tregs在胸腺中產(chǎn)生，而可誘導(dǎo)Tregs則在外周組織中，當(dāng)受到適當(dāng)刺激時(shí)產(chǎn)生。CD4+

10、T細(xì)胞的可塑性最近幾年才被認(rèn)識(shí)，通常CD4+T細(xì)胞并未達(dá)到分化末期，在一定的細(xì)胞因子環(huán)境下，保留著進(jìn)一步分化為其他亞型CD4+T細(xì)胞的潛能。從輔助性T細(xì)胞中產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子之間的相互影響及其平衡在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，然而其協(xié)調(diào)合作的內(nèi)在機(jī)制仍不明了。
　　 綜上所述，食物過敏發(fā)病機(jī)制仍未闡明，半抗原通過口服途徑暴露并與食物蛋白相結(jié)合可能能夠改變食物抗原的免疫原性，并成為食物過敏性疾病增加的環(huán)境誘導(dǎo)因素。肥大細(xì)胞不僅

11、在免疫炎癥反應(yīng)中是一種關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，參與速發(fā)型過敏反應(yīng)，而且，肥大細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和啟動(dòng)因素在固有免疫中也起重要作用，是否肥大細(xì)胞來源的絲氨酸蛋白酶能夠通過激活PAR-2來調(diào)控Th2中Bcl-6的表達(dá)仍不清楚。本研究中，我們將首先通過細(xì)胞培養(yǎng)，探討半抗原TNBS對(duì)DC表型的影響，其次通過給予小鼠TNBS和OVA混合物，建立針對(duì)食物抗原的小鼠腸道Th2型過敏反應(yīng)模型。通過本研究將初步探討食物過敏發(fā)病機(jī)制中新的環(huán)境誘導(dǎo)因素，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)模

12、型小鼠腸道中極化的Th2型過敏炎癥反應(yīng)。然后以經(jīng)典的小鼠卵清蛋白(OVA)腸道Th2型過敏反應(yīng)模型為研究基礎(chǔ)，采用肥大細(xì)胞缺陷小鼠，通過過繼轉(zhuǎn)移Th2細(xì)胞和骨髓來源肥大細(xì)胞來研究肥大細(xì)胞對(duì)腸道抗原特異性Th2型過敏反應(yīng)的免疫調(diào)控功能。采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)肥大細(xì)胞調(diào)控Th2細(xì)胞表達(dá)B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-6(Bcelllymphoma6protein，Bcl-6)功能和Bcl-6介導(dǎo)Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcel

13、l，Treg)的功能。結(jié)果顯示，TNBS和食物抗原OVA一起能夠誘導(dǎo)小鼠腸道極化的Th2型過敏反應(yīng)。和正常小鼠相比，過繼轉(zhuǎn)移Th2細(xì)胞能夠引起肥大細(xì)胞缺陷小鼠腸道強(qiáng)烈的Th2免疫反應(yīng)，激活的肥大細(xì)胞能夠引起活化的Th2細(xì)胞中Bcl-6表達(dá)增加，增加的Bcl-6進(jìn)一步誘導(dǎo)Th2細(xì)胞表達(dá)Foxp3(forkheadboxP3)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，而Th2型細(xì)胞因子表達(dá)則被抑制，從而使之轉(zhuǎn)變?yōu)門reg。而轉(zhuǎn)化而來的Treg具有抑

14、制其他Th2細(xì)胞活性的功能。本研究結(jié)果表明，半抗原可能是食物過敏發(fā)病中潛在的環(huán)境誘導(dǎo)因素之一，而激活的肥大細(xì)胞在抗原特異性Th2免疫反應(yīng)自我限制和免疫調(diào)控中具有重要作用。
　　 方法：
　　 1、骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC)的產(chǎn)生及培養(yǎng)
　　 無菌操作臺(tái)中取小鼠股骨和脛骨，浸入75％乙醇中3-5min，PBS沖洗骨髓腔3次，將骨髓細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心收集細(xì)胞加入紅細(xì)胞裂解液于室溫靜置5min，離心后棄上

15、清，再加入RPMI1640培養(yǎng)基10mL重懸細(xì)胞。用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，均勻后接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，48小時(shí)后全量換液，加入新鮮培養(yǎng)液及rmGM-CSF，rmIL-4繼續(xù)培養(yǎng)，每48h半量換液，并補(bǔ)足相應(yīng)細(xì)胞因子。培養(yǎng)后的BMDC經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)純度。
　　 2、TNBS對(duì)BMDC特性的影響
　　 收集誘導(dǎo)產(chǎn)生的BMDC（純度＞90％），96孔板培養(yǎng)（2×105細(xì)胞/孔）24

16、小時(shí)，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNBS（0-200ng/孔）共培養(yǎng)3天，3天后離心收集細(xì)胞，ELISA分析TIM4、CD80及IL-12p70表達(dá)水平。
　　 3、小鼠腸道黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞(LPMCs)分離
　　 無菌取小鼠小腸組織放入預(yù)冷的PBS中沖洗3次，轉(zhuǎn)移小腸組織到另一個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，PBS沖洗3次，將小腸組織剪成1cm長(zhǎng)大小，轉(zhuǎn)移進(jìn)15ml離心管，加入含0.15％DDT和1mMEDTA的PBS10ml，放入搖

17、床，37℃、65rpm搖20min。將腸組織剪成1mm大小碎片后放40μm濾網(wǎng)上，用注射器研磨并用PBS沖洗，用50ml離心管收集細(xì)胞。1500rpm離心10min去上清，用RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次，離心后用Percoll分離細(xì)胞，收集40％和80％的Percoll之間的懸浮細(xì)胞層，加入5mlRPMI1640培養(yǎng)液，1000g離心5min收集細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 4、免疫磁珠法(MACS)進(jìn)行細(xì)胞分選
　　 密度梯度

18、離心去除死細(xì)胞，過濾網(wǎng)制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，300g×10min離心棄去上清液，重懸細(xì)胞，每107加90μl細(xì)胞分選緩沖液。每107個(gè)細(xì)胞總數(shù)加入經(jīng)特異性抗體包被的免疫磁珠10μl，混勻，冰上共孵育15min。加入預(yù)冷的緩沖液1.5ml，300g×10min離心收集細(xì)胞后重懸，每108個(gè)細(xì)胞加入500μl緩沖液。把MS型細(xì)胞分選柱放入MACS分選架，加入細(xì)胞懸液，待液體流干后，加入500μl緩沖液沖洗共3次，收集的細(xì)胞為免疫磁

19、珠非結(jié)合細(xì)胞部分。把分選柱轉(zhuǎn)移出磁場(chǎng)，加入500μl緩沖液后，迅速把與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞推出，收集后的細(xì)胞為特異性抗體結(jié)合細(xì)胞。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)
　　 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，經(jīng)固定液冰上固定30min，離心收集細(xì)胞，加入1％的BSA冰上孵育30min。以1∶200的濃度加入一抗，混勻冰上孵育1h，PBS沖洗并離心后，收集細(xì)胞，以1∶200的濃度加入熒光標(biāo)記的二抗，冰上孵育30min，PBS沖洗2次后1

20、500rpm離心5min收集細(xì)胞。每管中加入400μl的PBS重懸細(xì)胞，40μm濾網(wǎng)過濾以去除細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACSCanto，BDBioscience).分析。
　　 6、半抗原誘導(dǎo)小鼠腸道食物過敏模型的建立
　　 雄性BALB/c小鼠（6-8周），每組6只，在第0、1、2、3、4天灌胃給予小鼠含TNBS（1mg/鼠）和OVA（100μg/鼠）的PBS0.3ml，第9、11、13天再次給予OVA（1mg/鼠

21、）灌胃進(jìn)行激發(fā)，最后一次灌胃24小時(shí)后處死小鼠，收集小鼠空腸組織用于下一步分析。
　　 7、腸道空腸組織中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　 取各組小鼠空腸組織經(jīng)4％的多聚甲醛固定，制作石蠟切片，組織切片經(jīng)HE染色（單個(gè)核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)）和Toluidineblue染色（肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)）。顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞(200×)，每只小鼠腸道隨機(jī)取20個(gè)鏡下區(qū)域計(jì)數(shù)。
　　 8、腸道抗原特異性Th2反應(yīng)評(píng)價(jià)
　　 分離的L

22、PMC（1×106/孔）經(jīng)CFSE染色標(biāo)記，并和OVA共同培養(yǎng)4天，收集細(xì)胞FACS分析細(xì)胞增殖情況及進(jìn)一步設(shè)門分析增殖細(xì)胞中CD3+IL-4+陽性細(xì)胞比率，收集培養(yǎng)上清液ELISA分析IL-4、IFN-γ表達(dá)量。
　　 9、ELISA進(jìn)行蛋白表達(dá)量檢測(cè)
　　 收集細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠血清-80℃儲(chǔ)存待測(cè)。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入濃度分別為0pg/mL，31.2pg/mL，62.5pg/mL，125pg/mL，250pg/mL

23、,500pg/mL，1000pg/mL，2000pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品100μL，在其余待測(cè)孔中加入待測(cè)上清液樣本100μL，每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)重復(fù)，用封板膜封上反應(yīng)孔，37℃60min。用洗滌液充分洗板后，加入酶標(biāo)試劑50μL，孔板置37℃30min，使用洗滌液充分洗板5次，甩掉洗滌液后倒置于濾紙上控干;每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，混勻4s后將孔板避光置37℃顯色15min。然后每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)，15分

24、鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm處讀出吸光度值，減去空白值即為所得吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中蛋白表達(dá)濃度。
　　 10、抗原特異性Th2細(xì)胞分離培養(yǎng)
　　 分離的OTⅡ小鼠脾臟細(xì)胞，經(jīng)免疫磁珠篩選去除其中CD8+T細(xì)胞，細(xì)胞(5×105/ml)在RPMI1640培養(yǎng)基中和卵清蛋白肽(OVA323-339)(1μg/ml)、IL-4(2ng/ml)、抗-IFN-γ抗體(5μg/ml)共培養(yǎng)4天。4天后，細(xì)胞加入IL-2(10n

25、g/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4天，培養(yǎng)第八天，經(jīng)MACS去除主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅱ+)陽性細(xì)胞，收集Th2細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 11、骨髓來源肥大細(xì)胞的產(chǎn)生
　　 50％的RPMI1640中加入2mML-谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸、抗生素和10％胎牛血清，和50％的WEHI-3細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基（作為IL-3的來源）混合制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)雄性WBB6F1-Kit+/+(Kit+/+，inshort)小鼠骨髓細(xì)胞，共

26、10周。3周后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMMC的產(chǎn)生比率。為進(jìn)一步致敏肥大細(xì)胞，106細(xì)胞/mlBMMC培養(yǎng)液中加入抗-OVAIgE(500ng/ml)或抗DNPIgE（抗二硝基苯酚抗體），培養(yǎng)過夜。
　　 12、過繼轉(zhuǎn)移和Th2細(xì)胞的體內(nèi)激活
　　 雄性清潔級(jí)BALB/c小鼠，6～8周，分為兩組，每組6只，極化的Th2細(xì)胞(107細(xì)胞/鼠;經(jīng)CFSE標(biāo)記)和BMMCs（2×106細(xì)胞/鼠）一起或Th2細(xì)胞單獨(dú)經(jīng)尾靜脈注入小鼠

27、體內(nèi)。小鼠隨后經(jīng)OVA(0.5mg/鼠)灌胃，每天一次，共3天。第4天處死小鼠，經(jīng)密度梯度離心法從小鼠小腸分離固有層單個(gè)核細(xì)胞(LPMCs)。
　　 13、實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)
　　 收集培養(yǎng)細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×107，1500rpm離心后收集細(xì)胞，酚氯仿法提取細(xì)胞總RNA，所提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)計(jì)算濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成:在PCR反應(yīng)E

28、p管中加入5倍Iscript反應(yīng)緩沖液4μl，Iscript反轉(zhuǎn)錄酶1μl，超純水13.5μl，RNA模版1μg，調(diào)整總反應(yīng)體系為20μl;反應(yīng)條件為:25℃5min,42℃40min，85℃5min，反應(yīng)產(chǎn)物放-20℃保存?zhèn)溆谩?5ngcDNA加入50μl1×SYBR-GreenIPCRmastermix中，上下游引物各200nM，進(jìn)行PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，陰性對(duì)照采用未轉(zhuǎn)錄RNA作為模版或不加入模版作為對(duì)照。根據(jù)標(biāo)

29、準(zhǔn)曲線定量mRNA表達(dá)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用擴(kuò)增5μl從細(xì)胞中獲得的不同濃度稀釋的總RNA（1.0-0.025ng/μl采用二倍稀釋法）。未知標(biāo)本中mRNA表達(dá)量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算得到，β-actin作為基因表達(dá)內(nèi)參照。
　　 14、RNA干擾（RNAi）
　　 構(gòu)建的包含小鼠PAR2和Bcl-6的shRNA和對(duì)照shRNA慢病毒載體購(gòu)自SantaCruz，并按照慢病毒載體操作說明轉(zhuǎn)染細(xì)胞。復(fù)蘇Lenti-X293T

30、細(xì)胞系，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察細(xì)胞是否貼壁并生長(zhǎng)良好。用Lenti-XHTX包裝系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝，充分混勻XfectPolymer，每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品需準(zhǔn)備2個(gè)離心管，充分混勻每管試劑，把管2添加到管1中，迅速渦旋10s，在室溫下孵育DNA-Xfect混合物10min，把1200μl的DNA-Xfect溶液加入準(zhǔn)備好的293T細(xì)胞中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使其均勻，在37℃條件下培養(yǎng)過夜，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，病毒滴度在48

31、h后可達(dá)到最高，吸取慢病毒懸液，500g離心10min，取懸液用Lenti-XGoStix鑒定病毒產(chǎn)物;然后用病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)前12h，在10ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)靶細(xì)胞至4×106個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋病毒株，獲得所需要的MOI(0.5-5)，以得到最佳的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在靶細(xì)胞中加入病毒懸液，轉(zhuǎn)導(dǎo)10h，移除丟棄存留病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，收集細(xì)胞進(jìn)行分析。經(jīng)westernblot檢測(cè)，基因抑制效率在轉(zhuǎn)

32、染后48小時(shí)達(dá)到90％，而對(duì)照組shRNA無基因抑制作用。
　　 15、共聚焦顯微鏡觀察
　　 取小鼠空?qǐng)鼋M織，去掉內(nèi)容物，PBS沖洗1次，加入OCT后迅速放入液氮中冰凍，冰凍組織切片后（4μm厚），室溫放置過夜，經(jīng)預(yù)冷的丙酮固定20分鐘，經(jīng)1％的小牛血清封閉30分鐘，加入一抗（0.5-1μg/ml）4℃孵育過夜。PBS沖洗組織3×5min，再加入熒光標(biāo)記的二抗(0.5-1μg/ml)室溫孵育1小時(shí)，然后經(jīng)PBS沖洗3×

33、5min，封片共聚焦顯微鏡觀察。
　　 16、統(tǒng)計(jì)分析
　　 數(shù)據(jù)記錄為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，采用非配對(duì)雙側(cè)t檢驗(yàn)或方差分析。Post-hoccomparisons經(jīng)Bonferroni'stest檢驗(yàn)分析。p＜0.05作為顯著性水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、半抗原TNBS可調(diào)控樹突狀細(xì)胞(DC)TIM4、CD80和IL-12的表達(dá)
　　 在BMDC中有少量的T1M4表達(dá)，當(dāng)在BMD

34、C細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TNBS后，TIM4表達(dá)呈一種劑量依賴性增長(zhǎng)（TNBS濃度0-60ng/ml時(shí)），而當(dāng)超過60ng/ml濃度時(shí)，加大培養(yǎng)液中TNBS濃度不能增加TIM4表達(dá)。BMDC中CD80表達(dá)量也隨培養(yǎng)液中TNBS濃度增加而增加。為進(jìn)一步探討TNBS對(duì)DC的影響，取各組小鼠空腸組織分離腸道黏膜DC，westernblot分析DC中TIM4、CD80和IL-12的表達(dá)。結(jié)果顯示，和生理鹽水對(duì)照組相比，TNBS+OVA組小鼠腸道DC中

35、TIM4、CD80表達(dá)量明顯增高(p＜0.01)，而DC中IL-12的表達(dá)量明顯減少(p＜0.01)。
　　 2、經(jīng)TNBS和OVA共同刺激后小鼠血清中OVA特異性IgE及組胺明顯增加
　　 和只灌胃給予OVA或TNBS組相比，TNBS+OVA組小鼠血清中具有高水平的OVA特異性IgE(p＜0.05);TNBS+OVA組小鼠血清中組胺的水平和生理鹽水對(duì)照組相比明顯增加(p＜0.05)。
　　 3、小鼠腸道OVA抗

36、原特異性Th2細(xì)胞極化
　　 分離小鼠腸道黏膜LPMC經(jīng)CFSE標(biāo)記后培養(yǎng)4天，培養(yǎng)液中加入特異性抗原OVA，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，和單獨(dú)給予OVA或TNBS灌胃組相比，TNBS+OVA組腸道LPMC中具有明顯的細(xì)胞增殖，增殖細(xì)胞部分經(jīng)設(shè)門分析顯示有93.9±12.2％的細(xì)胞為CD3+IL-4+T細(xì)胞。這一結(jié)果表明TNBS與OVA結(jié)合可誘導(dǎo)腸道Th2細(xì)胞極化。另外LPMC細(xì)胞培養(yǎng)液中Th1和Th2型細(xì)胞因子檢測(cè)，結(jié)果顯示，和對(duì)照組相

37、比，TNBS+OVA組小鼠LPMC細(xì)胞培養(yǎng)液中具有較高水平的IL-4，而IFN-γ水平較低(p＜0.05)。
　　 4、肥大細(xì)胞缺陷小鼠腸道中過繼轉(zhuǎn)移的Th2型炎癥反應(yīng)與正常小鼠過繼轉(zhuǎn)移的Th2型炎癥相比更強(qiáng)烈
　　 經(jīng)過繼轉(zhuǎn)移OVA特異性Th2細(xì)胞并經(jīng)OVA激發(fā)組，肥大細(xì)胞缺陷W/Wv小鼠腸道中OVA特異性Th2增殖明顯增加(39.1％)，而在同時(shí)過繼轉(zhuǎn)移OVA特異性Th2細(xì)胞和經(jīng)OVA特異性IgE抗體致敏的骨髓來源肥

38、大細(xì)胞(BMMC)，并經(jīng)OVA激發(fā)組，肥大細(xì)胞缺陷W/Wv小鼠腸道中OVA特異性Th2增殖較少(8.30％)。另外一組肥大細(xì)胞正常組Kit+/+小鼠也被過繼轉(zhuǎn)移CFSE標(biāo)記的OVA特異性Th2細(xì)胞，并經(jīng)OVA激發(fā)后，CFSE陽性Th2細(xì)胞增殖比率和只過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細(xì)胞的肥大細(xì)胞缺陷W/Wv小鼠組相近(39.7％)。CFSE陽性Th2細(xì)胞中IL-4mRNA表達(dá)量和Th2增殖比率呈正相關(guān)。
　　 5、激活的肥大細(xì)胞能夠

39、增加Th2細(xì)胞中Bcl-6的表達(dá)
　　 未經(jīng)刺激的Th2細(xì)胞中可檢測(cè)出低水平的Bcl-6的表達(dá)，而經(jīng)激活的肥大細(xì)胞刺激后，Th2細(xì)胞中Bcl-6表達(dá)量明顯增加，而在培養(yǎng)液中加入加入抗MMCP-6抗體能夠阻斷Th2細(xì)胞中Bcl-6的表達(dá)。把極化后的PAR2基因敲除Th2細(xì)胞和經(jīng)OVA特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞按上述程序共培養(yǎng)，結(jié)果顯示Th2細(xì)胞中的Bcl-6表達(dá)量被明顯阻斷。如在培養(yǎng)體系中加入活性PAR2肽刺激Th2細(xì)胞，則Bcl

40、-6的表達(dá)量明顯增加。預(yù)先用p38MAPK或ERK1/2拮抗劑處理Th2細(xì)胞，結(jié)果顯示被激活的肥大細(xì)胞誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞中Bcl-6的表達(dá)被明顯抑制，本結(jié)果表明PAR2相互作用增加Bcl-6的表達(dá)是通過MAPK途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 6、激活的肥大細(xì)胞能夠抑制活化的Th2細(xì)胞凋亡
　　 通過將抗原特異性的Th2細(xì)胞（經(jīng)CFSE標(biāo)記）和經(jīng)OVA特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞通過尾靜脈過繼轉(zhuǎn)移給W/Wv小鼠，并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)。

41、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在未經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠腸道中，有4.36％的CFSE陽性Th2細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細(xì)胞和OVA特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠腸道中，CFSE陽性Th2細(xì)胞發(fā)生凋亡比率為6.53％，和未激發(fā)組相比稍微增高。但在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細(xì)胞和未經(jīng)特異性抗原OVA致敏的肥大細(xì)胞組小鼠腸道中，抗原特異性Th2細(xì)胞凋亡比率明顯增加。這一結(jié)果表明，抗原特異性的IgE致敏

42、的肥大細(xì)胞能夠抑制抗原特異性的Th2細(xì)胞凋亡。
　　 7、激活的肥大細(xì)胞能夠使極化的Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門regs
　　 在收集的CFSE陽性Th2細(xì)胞（過繼轉(zhuǎn)移的Th2細(xì)胞）中，只過繼轉(zhuǎn)移Th2細(xì)胞組，F(xiàn)oxp3陽性T細(xì)胞比率只有1.44％，而在過繼轉(zhuǎn)移了Th2細(xì)胞和特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞組中，F(xiàn)oxp3陽性T細(xì)胞比率達(dá)到18.8％，但在過繼轉(zhuǎn)移了Th2和未致敏肥大細(xì)胞組，F(xiàn)oxp3陽性T細(xì)胞比率為1.13％。進(jìn)一步分

43、析在過繼轉(zhuǎn)移了Th2細(xì)胞和特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞組中，F(xiàn)oxp3陽性細(xì)胞表達(dá)高水平的TGF-β和少量的Th2型細(xì)胞因子。在過繼轉(zhuǎn)移了OVA特異性Th2細(xì)胞和OVA特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞并經(jīng)特異性抗原OVA激發(fā)組小鼠組腸道中，可觀察到Foxp3和CFSE雙陽性細(xì)胞。這一結(jié)果表明，當(dāng)暴露于激活的肥大細(xì)胞時(shí)，有一部分Th2效應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱薚regs。
　　 8、Bcl-6能夠抑制GATA3的表達(dá)從而促進(jìn)Th2細(xì)胞中Foxp

44、3的表達(dá)
　　 在未與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)組，細(xì)胞表達(dá)高水平的GATA3，而經(jīng)OVA特異性IgE抗體致敏的肥大細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞中GATA3表達(dá)被明顯抑制。在與OVA特異性IgE抗體未致敏的肥大細(xì)胞共培養(yǎng)組，和經(jīng)DNP-IgE致敏的肥大細(xì)胞共培養(yǎng)組中，細(xì)胞均表達(dá)高水平的GATA3。另外，Th2細(xì)胞中的Foxp3表達(dá)量與GATA3表達(dá)明顯呈負(fù)相關(guān)。而在Bcl-6阻斷的Th2細(xì)胞與致敏的肥大細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Th2表達(dá)低水平的Foxp3和高水

45、平的GATA3。本結(jié)果表明，激活的肥大細(xì)胞能夠上調(diào)Th2細(xì)胞中Bcl-6的表達(dá)，進(jìn)一步抑制GATA3的表達(dá)，從而使Foxp3表達(dá)增加。
　　 9、誘導(dǎo)產(chǎn)生的Tregs具有免疫抑制功能
　　 我們從上述實(shí)驗(yàn)中純化了CD4+CD25+TGF-β+Tregs和極化的Th2細(xì)胞（經(jīng)CFSE標(biāo)記）。加入抗CD3和抗CD28抗體，常規(guī)培養(yǎng)兩種細(xì)胞3天，流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果顯示，在未加入Tregs時(shí)，極化的CD4陽性T細(xì)胞明顯的增殖，

46、且細(xì)胞培養(yǎng)液中Th2型細(xì)胞因子表達(dá)量明顯增加，而在與Tregs共培養(yǎng)時(shí)，T細(xì)胞增殖及其Th2型細(xì)胞因子表達(dá)均被抑制。這一結(jié)果表明，轉(zhuǎn)變而來的Tregs具有免疫抑制功能。
　　 結(jié)論：
　　 1、食物過敏的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。本研究首次揭示半抗原是食物過敏發(fā)病中潛在的環(huán)境誘導(dǎo)因素之一。
　　 2、本研究通過給予小鼠半抗原TNBS和食物抗原OVA建立了一個(gè)小鼠食物過敏模型。
　　 3、TNBS能夠誘導(dǎo)腸道黏膜D

47、C細(xì)胞表達(dá)TIM4，而后者和CD4+T細(xì)胞上的TIM1相互作用，從而誘導(dǎo)腸道極化的Th2反應(yīng)。
　　 4、本研究國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞也具有免疫抑制功能并參與對(duì)急性過敏反應(yīng)自我限制的調(diào)控。
　　 5、闡明了肥大細(xì)胞對(duì)Th2型過敏反應(yīng)調(diào)控的分子機(jī)制，即激活的肥大細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Th2細(xì)胞表達(dá)Bcl-6，表達(dá)的Bcl-6能夠抑制Th2細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子的表達(dá)，并使其進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細(xì)胞。
　　 6、研究首次發(fā)現(xiàn)了另