RNAi沉默AQP-4技術治療膠質(zhì)瘤性腦水腫的實驗研究.pdf

1、目的：應用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術靶向沉默膠質(zhì)瘤內(nèi)水通道蛋白4（Aquaporin4，AQP-4）的表達，觀察其對膠質(zhì)瘤源性腦水腫的治療效果。
　　 方法：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫檢索出大鼠AQP-4的mRNA基因全長，將其編碼區(qū)用基因沉默設計軟件設計siRNA，寡核苷酸序列分別為①5’-AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3’,②5’-TAG GAC CGA AGG CATGA

2、G CGA CAA C-3’，③5′-GCG GAC GCC CAG AAA GAC CTG ATCC-3′。構建沉默AQP-4的siRNA質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細胞，G418進行篩選，免疫熒光化學方法檢測siRNA質(zhì)粒對AQP-4的沉默效果；建立SD大鼠顱內(nèi)C6膠質(zhì)瘤模型，分對照組、空載體轉(zhuǎn)染組和AQP-4 siRNA治療組；提取建模后第3、6、9、12天腦組織總RNA和總蛋白，RT-PCR和Western Blot方法檢測A

3、QP-4的mRNA和蛋白表達水平；干/濕比重法和Evans藍測定法檢測大鼠不同時相腦組織含水量和血腦屏障通透性改變；比較動物生存期。
　　 結果：細胞免疫熒光化學結果顯示C6膠質(zhì)瘤細胞胞漿和胞膜有低水平的AQP-4表達，轉(zhuǎn)染3個不同的siRNA后，AQP-4均有不同程度的降低，其中以①5′- AGA TCA GCA TCG CCA AGT C-3′核苷酸序列為siRNA的靶向沉默效果最好。后續(xù)體內(nèi)實驗即以此為治療核苷酸序列。RT

4、-PCR結果顯示對照組與空載組膠質(zhì)瘤隨時間延長，腫瘤體積增大，其AQP-4表達水平亦出現(xiàn)增高趨勢，但在相同時間點，二組間比較沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；治療組觀測全程可見AQP-4呈極低水平表達，在相同時間點與前兩組比較均有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。Western Blot結果與RT-PCR檢測結果變化趨勢相似，治療組觀測全程可見AQP-4呈極低水平表達，在相同時間點與對照組和空載組比較均有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。與對