CCL1-CCR8在小鼠支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及地塞米松對(duì)其作用的影響.pdf

1、背景及目的：
　　 支氣管哮喘是一種比較高發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病,其中青少年占了相當(dāng)大的比例。在我國(guó),隨著經(jīng)濟(jì)的高速增長(zhǎng)、人們生活方式的轉(zhuǎn)變,哮喘的發(fā)病率在逐年提高。目前傳統(tǒng)經(jīng)典的哮喘治療方案-吸入性糖皮質(zhì)激素和β2受體激動(dòng)劑對(duì)于防治哮喘發(fā)揮了重要的作用,但仍存在許多不盡如人意的地方,亟需尋找新的治療靶點(diǎn)和研制新型的抗哮喘藥物。隨著基因、分子技術(shù)的進(jìn)步,目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到炎癥趨化因子及其受體在炎性細(xì)胞趨化、募集過程中扮演了重要角色。而CC

2、L1-CCR8就是一對(duì)重要的趨化因子和受體,在體外實(shí)驗(yàn)中CCL1具有趨化、募集CCR8+炎性細(xì)胞的作用,而作為受體-CCR8優(yōu)勢(shì)性地表達(dá)在Th2淋巴細(xì)胞上,Th2淋巴細(xì)胞又在支氣管哮喘氣道炎癥形成上發(fā)揮了重要作用。CCL1-CCR8參與了多種炎癥性疾病,但目前對(duì)其在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中作用和地位存在許多爭(zhēng)議。另外糖皮質(zhì)激素作為重要的抗炎藥物,廣泛的應(yīng)用于哮喘治療,但其抗炎機(jī)制仍未完全明晰,特別是其能否抑制CCL1-CCR8的表達(dá)?是否通

3、過抑制CCL1-CCR8的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用?為此,本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制支氣管哮喘小鼠模型,在哮喘模型的基礎(chǔ)上于小鼠氣道內(nèi)滴注重組小鼠CCL1(rCCL1)來探索CCL1-CCR8在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用,并應(yīng)用地塞米松干預(yù)哮喘,研究其對(duì)CCL1-CCR8作用的影響。并藉此希望尋找到新的哮喘藥物治療靶點(diǎn)及糖皮質(zhì)激素抗炎新機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 40只清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠,隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為哮喘

4、組、rCCL1干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組、正常對(duì)照組。將新鮮配制的OVA和AL(OH)3的混懸液按0.2ml/只的劑量(含OVA100ug和AL(OH)32.25mg)于第1天、第14天以腹腔、皮下多點(diǎn)注射方式致敏小鼠,第25-31天,連續(xù)7天每天將小鼠置于密閉有機(jī)玻璃箱(40cm×35cm×20cm)中應(yīng)用霧化器霧化吸入2％OVA液30分鐘激發(fā)小鼠哮喘,制作哮喘模型。rCCL1干預(yù)組小鼠哮喘制作同哮喘組,但于最后一次激發(fā)后以0.3％戊巴比

5、妥(30mg/kg)麻醉后經(jīng)鼻道滴入rCCL1PBS液25ul/只(含2.5ugrCCL1)。地塞米松干預(yù)組小鼠哮喘制作同哮喘組,但在每次霧化激發(fā)前一小時(shí)給予腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(2mg/kg)。正常對(duì)照組小鼠制作程序同哮喘組,但致敏液和霧化激發(fā)液均以生理鹽水代替。最后一次激發(fā)后24h殺死小鼠,行肺泡灌洗,灌洗液離心,進(jìn)行細(xì)胞分類、計(jì)數(shù)。肺組織HE染色,采用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中的IL-4含量,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)半定量(

6、RT-PCR)檢測(cè)肺組織中CCR8mRNA和CCL1mRNA表達(dá)的水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1癥狀比較:哮喘組小鼠OVA激發(fā)后出現(xiàn)典型的哮喘癥狀；rCCL1干預(yù)組哮喘癥狀更為明顯,且有2只小鼠因出現(xiàn)重度哮喘導(dǎo)致死亡；地塞米松組小鼠較哮喘組小鼠明顯減輕；正常對(duì)照組小鼠未見異常癥狀。
　　 2肺組織病理:肺組織HE染色顯示哮喘組小鼠有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織結(jié)構(gòu)有破壞；

7、rCCL1干預(yù)組相比更為突出；地塞米松組小鼠較哮喘組減輕；正常對(duì)照組小鼠正常。
　　 3 BALF中IL-4濃度和細(xì)胞總數(shù)及分類:哮喘組、rCCL1組、地塞米松組和正常組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)分別為(9.1±0.9)×106,(9.7±0.8)×106,(4.2±0.5)×106,(1.7±0.4)×106；BALF中嗜酸性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例分別為(32.4±3.4)％,(39.0±7.1)％,(8.9±0.9)％,(0.6±

8、0.1)％；BALF中淋巴細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例分別為(14.0±3.0)％,(17.8±4.2)％,(6.3±0.6)％,(2.9±0.5)％:BALF中IL-4水平分別為(47.67±11.67)pg/ml,(57.95±9.24)pg/ml,(19.76±4.72)pg/ml,(5.16±1.23)pg/ml。
　　 4肺組織CCL1mRNA-CCR8mRNA表達(dá):哮喘組、rCCL1組、地塞米松組和正常組小鼠肺組織中CCL1m

9、RNA表達(dá)水平分別為0.76±0.16,1.02±0.31,0.53±0.13,0.11±0.06;CCR8mRNA表達(dá)水平分別為1.26±0.13,1.43±0.26,0.79±0.12,0.18±0.09。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:BALF中IL-4水平、細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量均rCCL1干預(yù)組>哮喘組>地塞米松組>正常對(duì)照組(差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05),同時(shí)在CCL1mRNA及CCR8mRNA的表達(dá)水平上