沙眼衣原體高分辨率溶解曲線基因分型方法的建立及其在男男性行為者流行病學調查中的應用.pdf

1、沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，CT）分15種血清型，其中A～C型是引起沙眼的主要病原體，D～K型主要引起泌尿生殖道感染，L1～L3型可以經性接觸傳播發(fā)生系統(tǒng)性感染而導致性病性淋巴肉芽腫(LymphogranulomaVenereum，LGV)。大部分的CT感染沒有臨床癥狀，但感染可持續(xù)存在并引起一系列女性、男性和新生兒的臨床疾病和后遺癥。LGV累及生殖器、肛門、直腸及淋巴結等，導致潰瘍、膿腫和瘺管的發(fā)生，晚期可引

2、起外生殖器橡皮腫、攣縮性瘢痕和直腸狹窄等嚴重后遺癥。
　　 CT是目前世界范圍內引起性傳播感染的最常見的病原體，據世界衛(wèi)生組織估計，每年全球新感染的CT感染病例數約為9200萬例。CT感染在許多發(fā)達國家已經超過淋病居所有STI的首位。LGV常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，但自2003年底來在歐洲和北美等國家的男男性行為人群(Menwhohavesexwithmen，MSM)中發(fā)生了爆發(fā)流行。我國90年代后報道的LGV疑似病例大多由于缺乏

3、有效地實驗室診斷手段未得到確診。
　　 目前的CT基因分型技術已經由建立在主要外膜蛋白(Majoroutermembraneprotein，MOMP)單克隆抗體基礎上的血清學分型發(fā)展到建立在CT的ompA基因擴增基礎上的基因分型。但這些分型方法都需額外步驟的PCR后分析，操作繁瑣、費時和容易污染，不適于大規(guī)模的流行病學調查和LGV的臨床診斷。實時熒光PCR技術(RT-PCR)已經應用到了CT基因分型研究，但主要是針對LGV型別，

4、而且Taqman探針的價格高，易分解，限制了其在流行病學中的應用。
　　 CT的基因分型研究有助于更好的了解不同基因型別的流行動態(tài)，地區(qū)和人群分布特征；有利于性傳播網絡的研究；了解感染和并發(fā)癥發(fā)生的機制；同時為CT疫苗的研究奠定基礎；CT基因分型還可作為診斷LGV的重要實驗室診斷依據。MSM人群中CT感染的分子流行病學研究目前我國尚未見報道，此人群中LGV的流行情況尚缺乏基線資料。本研究的目的是建立一種高效、快捷、穩(wěn)定的CT基因

5、分型方法，并應用于MSM人群中CT感染的分子流行病學研究。
　　 第一部分，沙眼衣原體ompA基因序列的分析和目的擴增片段的確定
　　 OmpA基因在CT內是單拷貝的，主要編碼MOMP蛋白的氨基酸序列，總長度約1.1kb左右，包括4個可變區(qū)（variablesegment，VS）和5個恒定區(qū)(constantsegment，CS)，其中VS區(qū)基因序列編碼MOMP主要抗原決定簇的氨基酸序列，是CT基因分型的基礎。為了篩選適

6、合高分辨率溶解曲線基因分型方法（High-resolutionmeltinganalysis，HRMA）的VS區(qū)域，我們從Genbank獲得15種型別的CT的ompA基因序列，用DNAstar5.0生物信息學軟件對ompA基因和4個VS區(qū)基因序列進行分析，初步確定片段最短，各型間離散性最大的VS2區(qū)作為HRMA基因分型的靶分析區(qū)域；然后在對15個型別的CT標準菌株進行復蘇、傳代培養(yǎng)的基礎上，設計引物擴增ompA基因VS1-VS2區(qū)，進一

7、步分析VS區(qū)基因序列；最后通過對36株臨床陽性標本的ompA基因VS1-VS2區(qū)擴增和變異性分析，同時結合文獻檢索的結果，最終確定VS2區(qū)作為HRMA基因分型的擴增和分析片段。
　　 第二部分，沙眼衣原體高分辨率溶解曲線基因分型方法的建立
　　 HRMA是一種全新的DNA擴增后分析技術，配合使用滲透性飽和染料，PCR擴增后升高溫度并監(jiān)測DNA雙鏈解開過程中熒光強度的變化，得到溶解曲線從而實現(xiàn)對PCR擴增產物的分析。我們設

8、計了針對ompA基因VS2區(qū)的通用巢氏RT-PCR擴增引物，擴增出11種與性傳播感染相關的CT的ompA基因VS2區(qū)并運用HRMA方法進行基因分型，敏感性可達到每個反應1個拷貝，與10種泌尿生殖道常見的病原體和共生菌之間無交叉反應；臨床標本檢測顯示其可對36份質粒擴增陽性的臨床標本全部擴增并分型，分型結果與測序分型結果一致；創(chuàng)建了11種與性傳播感染相關的沙眼衣原體的HRMA基因分型的工作流程。與現(xiàn)有的其他基因分型方法相比較，HRMA基因

9、分型方法可在擴增后直接通過軟件的溶解曲線分析和基因掃描分析來判斷標本的基因型，而不需要繁瑣的和額外步驟PCR后處理分析，成本效果性好、快速、簡單，并且大大減少了污染的幾率；LCGreen飽和染料不僅性質穩(wěn)定，易于儲存，而且對DNA雙鏈分子沒有破壞性，經過HRMA分析后的擴增產物仍可進行瓊脂糖凝膠電泳、測序等后續(xù)DNA分析。
　　 第三部分，男男性行為人群中沙眼衣原體的分子流行病學研究
　　 我們以南部沿海的深圳市的MSM

10、人群作為研究對象，2008年9月至2009年5月對深圳兩家MSM桑拿浴場的145名MSM進行調查，其中有143人(98.6％)同意參加本研究，由外展工作人員進行問卷調查并現(xiàn)場采集直腸和尿液標本。直腸拭子和尿液標本進行CT和淋球菌檢測，并對CT陽性標本進行基因分型。結果顯示人群中直腸CT感染率為24.4％，尿道CT和淋球菌感染率分別為5.3％和1.5％，其中2.5％的MSM直腸和尿道同時感染CT，沒有檢測到CT和淋球菌同時感染的情況；單因