廣州市某醫(yī)院腹瀉病人香港海鷗型菌和ETEC的檢測(cè)及耐藥性分析.pdf

1、1.研究目的：
　　 通過廣州市海珠區(qū)某三甲醫(yī)院門急診腹瀉病人香港海鷗型菌(laribacterHongkongensis,LH)和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(euterotoxigenic Excherichia coli,ETEC)的檢出與耐藥性,了解該區(qū)香港海鷗型菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的流行情況和耐藥情況以及該兩種細(xì)菌的合并感染率,感染的危險(xiǎn)因素和耐藥譜；評(píng)價(jià)其對(duì)人群健康和安全的潛在危險(xiǎn),并為臨床醫(yī)生的診斷和治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。<

2、br>　　 2.研究背景
　　 2.1 香港海鷗型菌
　　 2001年香港大學(xué)袁國(guó)勇教授和胡釗逸副教授在香港肝硬化病人的胸腔膿液和血液中首次分離出香港海鷗型菌,通過生化特性和16SrRNA基因序列等分析,發(fā)現(xiàn)此菌與其他屬細(xì)菌有很大不同,屬新發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌屬。2004年6月香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系發(fā)表在國(guó)際權(quán)威醫(yī)學(xué)雜志<柳葉刀》上一項(xiàng)最新研究成果,研究通過一個(gè)多中心的病例對(duì)照研究提出香港海鷗型菌可能是導(dǎo)致胃腸炎尤其是較嚴(yán)重胃

3、腸炎的因?yàn)橹?且食用淡水魚與外出旅游是該類腹瀉的主要危險(xiǎn)因素。目前,我國(guó)內(nèi)地對(duì)LH的研究還處于起步階段,且主要集中在淡水魚對(duì)該菌污染情況的調(diào)查,而關(guān)于人群感染狀況的研究近乎處于空白。迄今為止,僅有倪小平等從杭州市某醫(yī)院759例門診腹瀉病人中分離到4例LH的研究報(bào)告,尚未見其他人群帶菌情況的研究。廣東毗鄰香港,是淡水魚的主要供應(yīng)基地,且LH在淡水魚的檢出率高達(dá)41.7％。目前,LH已成為廣東淡水魚輸往香港的必檢致病菌之一,以防止LH類腹

4、瀉的發(fā)生。然而,廣東尚未見人群感染的研究報(bào)道,該菌對(duì)人群健康和安全的潛在危險(xiǎn)性尚不清楚。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)腹瀉,又被稱為嬰幼兒和旅游者腹瀉,為發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒腹瀉的重要病因,也是兒童、成人及旅游者腹瀉的病因之一。據(jù)港大醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系胡釗逸等報(bào)道,香港檢出的17名LH陽(yáng)性病人樣本中,有4名病人同時(shí)合并有其他致病菌的感染,其中3例就為ETEC,提示我們這兩種細(xì)菌是否更容易出現(xiàn)合并感染,從而加重腹瀉病人的癥狀。
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5、.2產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌
　　 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌于1968年在加爾各答首次被分離出,我國(guó)則于1974年在福建由林成水等首次分離出。國(guó)內(nèi)ETEC的檢出率研究集中于1995年一2002年,檢出率波動(dòng)范圍在1.89％-69.4％,其中在廣東較為系統(tǒng)正規(guī)的流行病學(xué)調(diào)查僅有三次,分別是1983年11月至1984年l0月對(duì)廣州市286例急性腹瀉的嬰幼兒所做的檢測(cè),檢出率為16.3％；1990-1991年在廣東某農(nóng)村針對(duì)兒童和成人腹瀉所進(jìn)行的

6、調(diào)查,檢出率為69.4％；1997年9月至10月在某野外駐訓(xùn)部隊(duì)的監(jiān)測(cè),檢出率為33.3％；檢測(cè)手段主要為敏感度和特異性較低的血清學(xué)診斷,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及高靈敏度的基因探針法。在距今接近11年的時(shí)間里,廣東對(duì)腹瀉病人ETEC的檢出僅限于對(duì)集體單位腹瀉爆發(fā)的調(diào)查,而對(duì)人群感染的危險(xiǎn)性無從知曉,國(guó)內(nèi)其他省市也存在同樣的監(jiān)測(cè)空白。
　　 2.3香港海鷗型菌和ETEC的耐藥性
　　 據(jù)文獻(xiàn)顯示,我國(guó)部分地區(qū)ETEC對(duì)第三代頭孢菌素的

7、耐藥率達(dá)44％-48％,對(duì)環(huán)丙沙星,左氧氟沙星的耐藥率已高達(dá)66.7％和65.7％,對(duì)哌拉西林,頭孢唑林的耐藥率與第三代頭孢菌素相似。對(duì)青霉素類,磺胺類,四環(huán)素高度耐藥,耐藥率高達(dá)72.4％-78.1％,僅對(duì)亞胺培南等碳青霉烯類抗生素敏感性很高。在杭州腹瀉病人身上檢測(cè)出的香港海鷗型菌對(duì)醫(yī)院常用的抗生素也表現(xiàn)出不同程度的耐藥,尤其是對(duì)青霉素類和第三代頭孢菌素類的耐藥性。細(xì)菌的耐藥性由于受到地域,醫(yī)生的用藥和個(gè)人自行服用抗生素等因素而呈現(xiàn)不

8、同的耐藥譜。廣州地區(qū)未見有人源LH的檢出株,且人群感染ETEC的監(jiān)測(cè)近十年未見有報(bào)道,所以對(duì)該兩種細(xì)菌的耐藥性也無從進(jìn)行評(píng)價(jià),無法給臨床醫(yī)生的用藥提供一定的科學(xué)依據(jù),導(dǎo)致在臨床治療過程中非敏感抗生素的使用,從而間接加重細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,所以耐藥性的檢測(cè)也成為本課題的主要研究目的之一。
　　 3.標(biāo)本收集和資料獲取
　　 2008年8月至2009年10月收集醫(yī)院感染疾病科門診,兒科門診,消化科門診和急診科胃腸炎患者的腹瀉標(biāo)

9、本。病人的一般情況、臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)資料通過自制的《感染性腹瀉調(diào)查表》獲得。
　　 4.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
　　 (1)標(biāo)本處理:標(biāo)本留取后30分鐘內(nèi)接種大腸桿菌培養(yǎng)肉湯(EC肉湯),麥康凱平板(MAC)和頭孢哌酮麥康凱平板(CMAC)。對(duì)于不能留取糞便的病人則取肛拭子床邊直接接種EC肉湯,MAC和CMAC。
　　 (2)香港海鷗菌的生化檢測(cè):CMAC37℃培養(yǎng)48h,EC肉湯常規(guī)培養(yǎng)6-8h。對(duì)于平板未長(zhǎng)菌的標(biāo)本則用

10、增菌后的EC肉湯再轉(zhuǎn)接平板繼續(xù)培養(yǎng)。挑取平板上細(xì)菌外形為0.5-1mm的無色、透明、扁平狀,邊緣光滑整齊的菌落進(jìn)行革蘭氏染色,氧化酶和觸酶實(shí)驗(yàn),結(jié)果為革蘭氏染色陰性,氧化酶和觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性且三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性者用API20NE做生化鑒定。
　　 (3)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的生化檢測(cè):MAC37℃培養(yǎng)18-24小時(shí),EC肉湯常規(guī)培養(yǎng)6-8h。對(duì)于平板未長(zhǎng)菌的標(biāo)本則用增菌后的EC肉湯再轉(zhuǎn)接平板繼續(xù)培養(yǎng)。挑取平板上直徑2-3mm粉紅色菌落,革蘭

11、氏染色為陰性桿菌,氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性,三糖鐵實(shí)驗(yàn)符合大腸桿菌生化特性的細(xì)菌進(jìn)行基因鑒定,基因鑒定陽(yáng)性的菌株再做API20E的生化鑒定。
　　 (4)基因檢測(cè):參考文獻(xiàn)合成引物,PCR擴(kuò)增香港海鷗型菌的16SrRNA;針對(duì)ETEC為擴(kuò)增其毒力基因:不耐熱腸毒素(LT),人源耐熱腸毒素(STh)和豬源耐熱腸毒素(STp)。
　　 (5)測(cè)序:對(duì)于擴(kuò)增片段在100bp以上的產(chǎn)物直接送往上海英竣公司進(jìn)行測(cè)序。產(chǎn)物在100bp以下的則

12、先進(jìn)行基因克隆,再將克隆菌液送往公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用GeneBank的BAST軟件進(jìn)行在線同源性分析。
　　 5.耐藥性分析
　　 采用WHO推薦的K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè),判定標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)CLSI/NCCLSM100-S19抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2009版)腸桿菌科抑制圈直徑的解釋標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。敏感(susceptible,S)率、中介(intermediate,I)率、耐藥(resistant,R)率分別用S％

13、、I％、R％表示。
　　 6.統(tǒng)計(jì)方法
　　 在Epidata3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù),數(shù)據(jù)進(jìn)行雙錄入,用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩樣本率的比較用x2檢驗(yàn)。
　　 7.結(jié)論
　　 LH作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的潛在病原菌,可能是導(dǎo)致胃腸炎尤其是較嚴(yán)重胃腸炎的因?yàn)橹?對(duì)人群感染情況的監(jiān)測(cè)是評(píng)估該菌對(duì)人群健康風(fēng)險(xiǎn)的潛在危險(xiǎn)的方法之一。此次在廣州某醫(yī)院646例腹瀉人群的調(diào)查中未能檢出LH,但由于是單中心調(diào)查,所以更大

14、的研究現(xiàn)場(chǎng),更多的樣本量對(duì)其感染風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估是必要的。
　　 作為與LH合并感染率最高的ETEC,通過此次監(jiān)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)該菌的檢出率較低,僅為6％,檢出的基因型別以STh為主。ETEC引起的腹瀉常為水樣瀉,臨床表現(xiàn)較重,嚴(yán)重者1天可達(dá)20多次,所以臨床上對(duì)水樣腹瀉的患者的診斷應(yīng)想到與檢出率很低的本病鑒別,避免誤診誤治。
　　 ETEC感染的患者中有55％(21/38)的人有食用水產(chǎn)品以及48％(17/38)的人有外出進(jìn)食,