門診腹瀉患者志賀菌耐藥性及基因型研究.pdf

1、目的和意義：通過調(diào)查武漢市2004年流行季節(jié)門診腹瀉患者志賀菌感染狀況，分析志賀菌血清型分布及耐藥現(xiàn)狀，并與2003年做相關(guān)比較，研究志賀菌中氟喹諾酮作用靶位點(diǎn)的改變導(dǎo)致氟喹諾酮耐藥的機(jī)制，并用分子生物學(xué)方法對(duì)志賀菌進(jìn)行基因分型，為志賀菌耐藥性監(jiān)測(cè)、臨床合理用藥、新藥和疫苗開發(fā)及流行病學(xué)研究提供理論依據(jù)。 方法：收集2004年6月～11月武漢市四所大型醫(yī)院門診腹瀉患者的糞便標(biāo)本，培養(yǎng)分離志賀菌，進(jìn)行生化及血清型鑒定。瓊脂稀釋法測(cè)

2、定志賀菌對(duì)12種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimuminhibitionconcentration，MIC)，紙片擴(kuò)散法測(cè)定志賀菌對(duì)另外7種抗菌藥物的藥物敏感性。結(jié)果分析采用WHONET5.3軟件和SPSS11.5軟件，并與2003年數(shù)據(jù)比較。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)對(duì)志賀菌DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA基因和拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣparC基因擴(kuò)增、測(cè)序，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸埃希菌的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)

3、，查找突變點(diǎn)。應(yīng)用重復(fù)基因外回文序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(repetitiveextragenicpalindromic-polymerasechainreaction，REP-PCR)對(duì)志賀菌進(jìn)行基因分型。 結(jié)果：2004年6月～11月在武漢市四所大型三級(jí)甲等醫(yī)院門診患者中共收集糞便標(biāo)本5079份，分離出志賀菌29株(0.57％)，其中B群12株(41％)，D群17株(59％)。B群檢出三個(gè)血清亞型，分別為fla2株(16.7％)

4、，f2a4株(33.3％)和f4c6株(50％)。 志賀菌對(duì)19種抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)結(jié)果顯示，復(fù)方新諾明耐藥率最高為100％，萘啶酸、四環(huán)素、大觀霉素和氨芐西林為72.4％～96.6％，氯霉素和阿莫西林+克拉維酸的耐藥率為41.4％和31％，慶大霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟為10.3％～17.2％，卡那霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星為6.9％～7.1％，左氧氟沙星、莫西沙星和呋喃妥因均為3.4％，未檢出頭孢他啶、頭孢吡肟和氨曲南的耐藥株

5、。只發(fā)現(xiàn)2株志賀菌對(duì)氟喹諾酮耐藥。 29株志賀菌有20種耐藥模式，無全敏感株，少則耐兩種，多則耐12種。B群志賀菌以氨芐西林—大觀霉素—氯霉素—四環(huán)素—復(fù)方新諾明—萘啶酸(ASHTRD)六聯(lián)耐藥為主，占50％(6/12)；D群志賀菌有2種主要的耐藥模式，分別為大觀霉素—四環(huán)素—復(fù)方新諾明—萘啶酸(STRD)四聯(lián)耐藥和氨芐西林—頭孢曲松—大觀霉素—氯霉素—四環(huán)素—復(fù)方新諾明—萘啶酸—阿莫西林+克拉維酸—頭孢噻肟(AFSHTRDXC

6、)九聯(lián)耐藥，各有2株。 和2003年數(shù)據(jù)相比，2004年門診志賀菌分離率升高0.13％，D群比例超過B群。2004年志賀菌對(duì)氨曲南耐藥率下降16.7％，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥率上升20.8％，差異均有顯著性。 2株氟喹諾酮耐藥志賀菌編號(hào)為4194和3222，二者諾氟沙星和環(huán)丙沙星的MIC均為16μg/ml和4μg/ml；3222株左氧氟沙星和莫西沙星的的MIC均為8μg/ml，4194株左氧氟沙星和莫西沙星的的MIC均為4μg

7、/ml。靶位基因突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：4194株和3222株在gyrA基因喹諾酮抗性決定區(qū)(quinoloneresistance-determingregion，QRDR)都存在87位Asp(GAC)→Asn(AAC)點(diǎn)突變，在QRDR外都存在177位Gly(GGT)→Ser(AGT)點(diǎn)突變。除此之外，3222株還有204位Ser(AGC→Ile(AAC)點(diǎn)突變，4194株還有120位Met(ATG)→Leu(CTG)、203位Ile(ATC

8、)→Leu(CTC)、204位Ser(AGC)→Thr(ACC)和205位Ile(ATT)→Leu(CTT)的點(diǎn)突變。兩株菌parC基因均未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變。 REP-PCR基因分型結(jié)果提示：16株D群志賀菌有A～G七種指紋圖譜。A型分為四個(gè)亞型，即A1、A2、A3和A4，除A1有3株外，其余各1株；B型的B1和B2亞型各1株；C型的C1和C2亞型各2株；D、E、F和G型各1株。 12株B群志賀菌有兩種指紋圖譜，分為H和K型。

9、H型有H1、H2和H3三種亞型，各1株；K型的亞型和株數(shù)分別為K12株，K24株，K32株，K41株。 散發(fā)分離的菌株有相同或相似的指紋圖譜，基因型相同的菌株有不同的耐藥表型，相同的耐藥表型可對(duì)應(yīng)不同的基因型。 結(jié)論： 2004年武漢市門診患者中志賀菌感染率較2003年略有升高，D群菌株數(shù)大于B群，B群中f4c比例上升。 2004年門診分離志賀菌耐藥性嚴(yán)重，耐藥模式繁多。2003年和2004年志賀菌耐藥性