廣東地區(qū)醫(yī)院感染銅綠假單胞菌的基因分型及耐藥性研究.pdf

1、研究目的和內(nèi)容：
　　 1.了解廣東地區(qū)醫(yī)院感染病原體銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的耐藥情況,掌握地區(qū)差異及耐藥譜隨時(shí)間變化趨勢(shì),為臨床選擇適當(dāng)?shù)目股靥峁┮罁?jù)。
　　 2.探索優(yōu)化適合銅綠假單胞菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed-field gelelectrophoresis,PFGE)條件,了解醫(yī)院感染病原體PA分離株的基因多態(tài)性,闡明其菌株間的遺傳親緣關(guān)系。
　　 3.

2、結(jié)合流行病學(xué)資料分析 PA基因圖譜的聚類分析結(jié)果,鑒別優(yōu)勢(shì)克隆菌株的時(shí)間、地區(qū)以及人群的三間分布,判斷爆發(fā)菌株和散發(fā)菌株。
　　 4.了解多重耐藥銅綠假單胞菌(Multi-drug resistance pseudomonasaeruginosa,MDRP)常見耐藥基因的攜帶情況,分析比較其耐藥譜、基因圖譜以及耐藥基因攜帶的關(guān)系。
　　 研究方法：
　　 1.菌株的收集方法:2008年1月-2010年8月,對(duì)廣東

3、地區(qū)四所三甲醫(yī)院(汕頭中心醫(yī)院、深圳兒童醫(yī)院、廣東藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院及廣州胸科醫(yī)院)住院的醫(yī)院感染患者送檢的痰、血液、尿液、糞便和膿液等樣本,由醫(yī)院進(jìn)行銅綠假單胞菌的分離鑒定,菌株經(jīng) VITEK232全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國(guó)Bio2Merieux)鑒定,并剔除同一患者相同樣本重復(fù)菌株。
　　 2.抗生素敏感性測(cè)定方法:按美國(guó)臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn),采用紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株進(jìn)行15種抗菌藥物的體外藥物敏感試驗(yàn)。
　　 3.

4、基因分型方法:建立適合銅綠假單胞菌的 PFGE分型的實(shí)驗(yàn)室條件,對(duì)分離株進(jìn)行PFGE基因分型,采用Bionumerics V4.0軟件中的非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,分析菌株間的親緣關(guān)系。
　　 4.PCR擴(kuò)增法檢測(cè)多重耐藥銅綠假單胞菌分離株中的外膜孔蛋白 OprD2及金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.廣東地區(qū)2008—2010年醫(yī)院感染PA的藥物敏感性結(jié)果
　　

5、 1.1 PA藥敏的總體情況
　　 本研究共分離到376株醫(yī)院感染銅綠假單胞菌,對(duì)15種常用抗生素(青霉素類、頭孢菌素類、其他β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、喹諾酮類、磺胺類)均表現(xiàn)出不同程度的耐藥。耐藥率從高到低依次如下:頭孢唑啉(99.7％)、氨芐西林/舒巴坦(99.5％)、氨芐西林(98.9％)、復(fù)方新諾明(98.7％)、頭孢噻肟(80.6％)、慶大霉素(50.896)、氨曲南(46.5％)、哌拉西林/三唑巴坦(45.1％)、頭

6、孢砒肟(44.7％)、左氧氟沙星(39.9％)、美羅培南(39.1％)、頭孢他啶(38.0％)、阿米卡星(37.5％)、環(huán)丙沙星(37.0％)、亞胺培南(34.6％)。未發(fā)現(xiàn)泛耐藥及全敏感菌株。分離株幾乎對(duì)所有的青霉素類、磺胺類及一代頭孢菌素表現(xiàn)出全耐藥,對(duì)氨基糖甙類、喹諾酮類,特別是碳青霉烯類和三代頭孢敏感性較高。
　　 1.2 PA藥敏的地區(qū)差異
　　 三地區(qū)藥敏情況表現(xiàn)略有不同,大部分表現(xiàn)為逐年遞增,汕頭地區(qū)的亞胺

7、培南從2008年的27.3％遞增到2010年的59.6％,深圳的亞胺培南、頭孢他啶也從2008年的4.2％,4.2％到2010年的2096和23.3％,而廣州地區(qū)的藥敏結(jié)果顯示包括亞胺培南和頭孢他啶在內(nèi)的大部分抗菌素從2008年的高耐藥到2009年有所回落再到2010年慢慢上升的趨勢(shì)。深圳地區(qū)2009—2010年間耐藥情況增長(zhǎng)幅度大,多數(shù)藥物耐藥性呈翻倍增長(zhǎng),尤為明顯的是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢砒肟、環(huán)丙沙

8、星及左氧氟沙星。耐藥特點(diǎn)比較結(jié)果顯示:2008—2010年間,汕頭地區(qū)PA耐藥率變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南及哌拉西林/三唑巴坦；深圳地區(qū)是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、頭孢噻肟、頭孢砒肟及左氧氟沙星；廣州地區(qū)是阿米卡星、慶大霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟、哌拉西林/三唑巴坦及復(fù)方新諾明。
　　 1.3 PA藥敏的時(shí)間變化趨勢(shì)
　　 汕頭和廣州地區(qū)耐藥情況較為普遍,相對(duì)地,深圳地區(qū)藥物敏感度較高。2008年

9、,阿米卡星、頭孢砒肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星在深圳地區(qū)未發(fā)現(xiàn)其耐藥株,在汕頭的耐藥性已分別高達(dá)33.3％、48.5％、45.5％、33.3％,廣州是44.1％、73.5％、58.8％、64.7％。汕頭和廣州耐藥性變化較為緩慢或略有下降,深圳地區(qū)耐藥性隨年遞增快,2008年汕頭、深圳、廣州的亞胺培南耐藥性分別是27.3％、4.2％及50.0％,頭孢他啶耐藥性分別是57.6％、4.2％及64.7％,到2010年,汕頭、深圳和廣州亞胺培南耐藥率

10、分別是59.6％、20.0％和41.7％,頭孢他啶分別是46.2％、23.3％和40.6％。耐藥特點(diǎn)比較結(jié)果顯示:2008年三地區(qū)耐藥性變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢砒肟、氨曲南、哌拉西林/三唑巴坦、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星;2009年有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢砒肟、氨曲南、哌拉西林/三唑巴坦、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星；201

11、0年有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、頭孢砒肟、氨曲南、氨芐西林、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星。
　　 1.4多重耐藥銅綠假單胞菌分離株的檢出情況
　　 376株銅綠假單胞菌中共有84株為多重耐藥,多重耐藥率為22.3％,呈逐年遞增趨勢(shì)。多重耐藥率比較三地區(qū)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=39.29,P=0.000)。汕頭、深圳地區(qū)多重耐藥率逐年遞增,尤為明顯的是汕頭地區(qū),三年多重耐藥率分別是18.2％、40.

12、7％、53.8％。多重耐藥特點(diǎn)比較結(jié)果顯示:三年間同一地區(qū)多重耐藥率變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是汕頭地區(qū)(x2=10.69,P=0.005),深圳地區(qū)(x2=9.78,P=0.008)；三地區(qū)間同一時(shí)間多重耐藥率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是2008(x2=6.30,P=0.043),2009(x2=24.39,P=0.000),2010(x2=21.15,P=0.000)。
　　 2.醫(yī)院感染銅綠假單胞菌的PFGE基因分型
　　 2.

13、1適應(yīng)于銅綠假單胞菌的PFGE實(shí)驗(yàn)室條件建立
　　 當(dāng)OD值為5.2,裂解時(shí)間為20h,限制性內(nèi)切酶SpeI20U酶切20h,電泳脈沖時(shí)間為2.16s-63.8s,脈沖角度為120°,電場(chǎng)強(qiáng)度為6V/cm,電泳19:30h時(shí),PA的PFGE實(shí)驗(yàn)圖譜條帶數(shù)目、大小、亮度及長(zhǎng)度均非常合適。
　　 2.2376株醫(yī)院感染銅綠假單胞菌基因分型概況及流行病學(xué)調(diào)查
　　 在使用相同的試劑、儀器和參數(shù)的前提下,376株菌經(jīng)限制

14、性內(nèi)切酶 SpeI酶切后進(jìn)行PFGE電泳,每株約出現(xiàn)13—20個(gè)電泳條帶,分子量在30kb-700kb之間。經(jīng)Bionumerics V4.0軟件進(jìn)行聚類分析,相似值在34.2％～100％之間,可分為357個(gè)型(相似值為100％視為同-PFGE型別),共出現(xiàn)16對(duì)涉及35株菌同源性為100％,其中汕頭共出現(xiàn)4對(duì)8株,均發(fā)生于ICU與神經(jīng)外科病房之間的心腦損傷患者的痰與血液樣本,同源菌株檢出的時(shí)間間隔不超過(guò)兩個(gè)月；深圳是7對(duì)17株,基本都

15、是從痰標(biāo)本中檢出,多發(fā)生于ICU及內(nèi)科病房,同源菌株檢出時(shí)間間隔多數(shù)在1個(gè)月內(nèi)到4個(gè)月之間,最長(zhǎng)是8個(gè)月；廣州3對(duì)6株,基本都是來(lái)自內(nèi)科病房的呼吸道患者,時(shí)間間隔在一個(gè)月內(nèi)到兩個(gè)月之間；另外有兩對(duì)4株分別是廣州胸科醫(yī)院和深圳兒童醫(yī)院之間,時(shí)間分別是2010年10月和2009年6月,標(biāo)本來(lái)源是痰液和大便,以及廣州胸科醫(yī)院和汕頭中心醫(yī)院之間的同一肺疾患者不同時(shí)間(2010年的1月和2009年的10月)痰標(biāo)本中檢出。
　　 2.384

16、株多重耐藥銅綠假單胞菌的基因分型
　　 84株多重耐藥的PA經(jīng)Bionumerics V4.0軟件進(jìn)行聚類分析,相似值在62.5％～100％之間,可分為75個(gè)型,出現(xiàn)6組同源菌株。不同地區(qū)各自出現(xiàn)多個(gè)聚類高峰,尤其是汕頭,有7株菌的同源性在90.7％及以上。另外,6組同源菌株中有4組(各2株)來(lái)自汕頭,1組(3株)來(lái)自深圳,一組出現(xiàn)于廣州和汕頭兩地區(qū)之間。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果表明在相似度為90％、85％和80％時(shí),多重耐藥株與總分離株的

17、分型率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.434株耐藥基因陽(yáng)性銅綠假單胞菌的基因分型
　　 聚類分析顯示34株基因陽(yáng)性菌株的銅綠假單胞菌相似值在64.6％～100％之間,可分為31個(gè)型,出現(xiàn)多個(gè)聚類高峰,呈現(xiàn)地區(qū)聚集,當(dāng)相似度為90％時(shí),可分為24型,當(dāng)相似度為80％時(shí),僅可分為13型,共出現(xiàn)2組同源菌株,分別是來(lái)自汕頭(2株)和深圳(3株)。
　　 3.多重耐藥銅綠假單胞菌分離株的耐藥機(jī)制研究
　　 3.1

18、外膜孔蛋白OprD2檢出情況
　　 84株多重耐藥銅綠假單胞菌中共檢出30株OprD2缺失,缺失率為35.71％,其中汕頭是13.35％(6/45),深圳是75％(3/4),廣州是60％(21/35)。
　　 3.2金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)情況
　　 汕頭地區(qū)未檢出金屬酶陽(yáng)性銅綠假單胞菌；廣州共檢出4株IMP和2株VIM陽(yáng)性,檢出率分別是11.4％和5.7％；深圳檢出2株VIM陽(yáng)性,陽(yáng)性率為50％,經(jīng)測(cè)序比對(duì),均為

19、IMP-1及VIM-2型。三地區(qū)SPM均未檢出。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.廣東地區(qū)醫(yī)院感染PA耐藥情況普遍,對(duì)頭孢唑啉、氨芐西林/舒巴坦、氨芐西林及復(fù)方新諾明的耐藥接近100％,對(duì)氨基糖甙類、喹諾酮類尤其是碳青霉烯類和頭孢他啶敏感性相對(duì)較高,總體上所有抗菌素的耐藥性呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì),不同地區(qū)不同時(shí)間均表現(xiàn)出不同的耐藥特點(diǎn),從區(qū)域上看,汕頭廣州耐藥性較深圳普遍,從時(shí)間上看,耐藥增長(zhǎng)率深圳>汕頭>廣州；另一方面,多重耐藥

20、株檢出率高達(dá)22.3％,呈逐年遞增趨勢(shì),增長(zhǎng)率汕頭>深圳>廣州。
　　 2.PFGE在分子水平上有強(qiáng)大的鑒別能力,是一種穩(wěn)定、精確的基因分型方法,適合作為院內(nèi)感染的同源性分析。
　　 3.2008—2010年間廣東不同地區(qū)的多家醫(yī)院病房中存在銅綠假單胞菌的優(yōu)勢(shì)克隆株,三地區(qū)均出現(xiàn)過(guò)小規(guī)模的院內(nèi)流行傳播,ICU病房出現(xiàn)頻率高,交叉感染可出現(xiàn)于不同科室之間。另外,不同地區(qū)之間出現(xiàn)基因型完全一致菌株,揭示及時(shí)的流行病學(xué)調(diào)查的重

21、要性。多重耐藥銅綠假單胞菌分離株,尤其是耐藥基因陽(yáng)性的菌株的基因多態(tài)性集中,更容易引起交叉感染。
　　 4.廣東地區(qū)亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制以外膜孔蛋白OprD2缺失為主,其次是攜帶IMP-1和VIM-2金屬酶基因,未發(fā)現(xiàn)攜帶其他金屬酶基因,外膜孔蛋白OprD2和金屬β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的耐藥可以獨(dú)立也可以協(xié)同起作用。除此之外,亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌存在其他的耐藥機(jī)制。
　　 5.耐藥圖譜、PFGE圖譜以及耐藥基